Dùng phần mềm MODDE 9.0 để thiết kế thí nghiệm dựa trên mặt hợp tử tại tâm rút gọn, kết quả được xử lý bằng phần mềm FormRules v2.0, INForm v3.1 để tìm ra mối quan hệ giữa các biến độc lập và các biến phụ thuộc.
3.3.1. Thiết kế thí nghiệm 3.3.1.1. Lựa chọn biến đầu ra
Bảng 3.17. Bảng ký hiệu và mức cần đạt được của các biến đầu ra
STT Biến Ký hiệu Đơn vị Mục tiêu
1 Hàm lượng flavonoid glycosid còn lại
Y1 % Max
2 ΔpH Y2 Min
48 3.3.1.2. Lựa chọn biến đầu vào
Từ các đánh giá sơ bộ ở trên, các biến đầu vào được lựa chọn trong bảng 3.18.
Bảng 3.18. Bảng ký hiệu và yêu cầu của các biến đầu vào
STT Biến Ký hiệu Đơn vị Loại biến Giới hạn
1 pH X1 Định lượng 6 đến 7,5
2 Dinatri edetat X2 % Định lượng 0,01 đến 0,05
3 Sorbitol X3 % Định lượng 10 đến 15
4 Natri metabisulfit X4 % Định lượng 0,1 đến 0,3
3.3.1.3. Thiết kế thí nghiệm
Thiết kế mặt hợp tử tại tâm nhờ phần mềm MODDE 9.0 thu được bảng thiết kế thí nghiệm gồm 27 thí nghiệm trong đó có 3 thí nghiệm trung tâm.
STT Mẫu pH Dinatri edetat (%)
Sorbitol (%)
Natri metabisulfit (%)
1 18 6 0,01 10 0,1
2 19 7,5 0,01 10 0,1
3 20 6 0,05 10 0,1
4 21 7,5 0,05 10 0,1
5 22 6 0,01 15 0,1
6 23 7,5 0,01 15 0,1
7 24 6 0,05 15 0,1
8 25 7,5 0,05 15 0,1
9 26 6 0,01 10 0,3
10 27 7,5 0,01 10 0,3
11 28 6 0,05 10 0,3
12 29 7,5 0,05 10 0,3
13 30 6 0,01 15 0,3
14 31 7,5 0,01 15 0,3
49
15 32 6 0,05 15 0,3
16 33 7,5 0,05 15 0,3
17 34 6 0,03 12,5 0,2
18 35 7,5 0,03 12,5 0,2
19 36 6,75 0,01 12,5 0,2
20 37 6,75 0,05 12,5 0,2
21 38 6,75 0,03 10 0,2
22 39 6,75 0,03 15 0,2
23 40 6,75 0,03 12,5 0,1
24 41 6,75 0,03 12,5 0,3
25 42 6,75 0,03 12,5 0,2
26 43 6,75 0,03 12,5 0,2
27 44 6,75 0,03 12,5 0,2
3.3.2. Tiến hành thí nghiệm
Pha các mẫu thuốc tiêm theo các công thức trong bảng thiết kế thí nghiệm trên, mỗi mẫu pha 100 ml, đóng lọ thủy tinh không màu 10 ml, đậy nút cao su, xiết nắp nhôm, các mẫu được đun sôi 8 giờ.
Về cảm quan: các mẫu sau khi luộc sôi có màu vàng, trong. Định lượng hàm lượng flavonoid glycosid còn lại và đo pH để xác định sự thay đổi pH thu được kết quả trong bảng 3.19.
Bảng 3.19. Kết quả thực nghiệm giá trị các biến đầu ra (n=1)
STT Mẫu Hàm lƣợng flavonoid
glycosid còn lại (%) ΔpH
1 18 97,5 0,41
2 19 94,1 0,33
3 20 96,1 0,33
4 21 93,9 0,32
5 22 98,0 0,32
6 23 96,4 0,36
50
7 24 97,9 0,39
8 25 93,6 0,39
9 26 97,3 0,18
10 27 94,6 0,28
11 28 96,3 0,31
12 29 94,5 0,29
13 30 98,2 0,28
14 31 94,9 0,31
15 32 98,2 0,24
16 33 93,2 0,39
17 34 98,3 0,27
18 35 93,5 0,26
19 36 98,6 0,17
20 37 97,4 0,18
21 38 97,9 0,18
22 39 98,3 0,18
23 40 97,9 0,19
24 41 98,1 0,20
25 42 98,0 0,19
26 43 97,7 0,17
27 44 97,9 0,21
3.3.3. Ảnh hưởng của các biến đầu vào đến các biến đầu ra
Dùng phần mềm INForm v3.1 để xử lý số liệu của các biến đầu vào và biến đầu ra thu được kết quả trong bảng 3.20.
Bảng 3.20. Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo Biến phụ
thuộc
Số đơn vị đầu vào
Số đơn vị đầu ra
Số đơn vị ẩn
Số lần
luyện R2 luyện
Y1 5 1 1 10000 95,1737
Y2 5 1 1 10000 93,0308
51 Nhận xét:
Kết quả xử lý cho thấy R2 luyện của các biến đều lớn hơn 80% chứng tỏ quan hệ giữa biến độc lập và biến phụ thuộc được mô tả chính xác bằng mạng neuron nhân tạo. Phân tích ảnh hưởng của các biến độc lập đến các biến phụ thuộc bằng phần mềm FormRules v2.0 cho kết quả thể hiện trong bảng 3.21.
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của biến độc lập đến biến phụ thuộc.
Biến phụ thuộc Biến độc lập
Y1 (%)
Y2
X1 + +
X2 - +
X3 - +
X4 + +
Ghi chú “+”: có ảnh hưởng; “-” : không ảnh hưởng.
Mặt đáp hình 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8 thể hiện rõ hơn ảnh hưởng của các biến đầu vào đến các biến đầu ra:
52
Hình 3.4. Mặt đáp của ΔpH theo nồng độ natri metabisulfit và pH (Y1, X1, X4) khi natri edetat là 0,03% và sorbitol là 12,5%.
Nhận xét:
Mặt đáp ở hình 3.4 cho thấy ảnh hưởng của natri metabisulfit đến sự ổn định của pH thuốc tiêm trong mối liên hệ với giá trị pH.
ΔpH nhỏ nhất khi nồng độ natri metabisulfit khoảng 0,12% và cao nhất khi nồng độ natri metabisulfit cao nhất là 0,3%.
Ứng với nồng độ natri metabisulfit trung gian 0,2% thì giá trị ΔpH giảm dần theo sự giảm của pH, tức là pH càng nhỏ thì chênh lệch pH càng nhỏ.
Với các vùng khác, ΔpH có sự biến đổi phức tạp theo nồng độ của natri metabisulfit và giá trị pH.
pH Natri metabisulfit (%)
ΔpH
53
Hình 3.5. Mặt đáp của Hàm lượng flavonoid glycosid còn lại còn lại theo nồng độ dinatri edetat và pH (Y2, X1, X2)
khi dinatri metabisulfit là 0,2% và sorbitol là 12,5%.
Hình 3.6. Mặt đáp của Hàm lượng flavonoid glycosid còn lại còn lại theo nồng độ natri metabisulfit , pH (Y2, X1, X4)
khi natri edetat là 0,03% và sorbitol là 12,5%.
Na metabisulfit pH (%)
Hàm lượng flavonoid glycosid còn lại (%)
Dinatri edetat (%) pH
Hàm lượng flavonoid glycosid còn lại (%)
54
Hình 3.7. Mặt đáp của Hàm lượng flavonoid glycosid còn lại theo nồng độ natri metabisulfit và dinatri edetat (Y2, X2, X4) khi pH=6,75 và sorbitol là 12,5%
Nhận xét:
Hình 3.6, 3.7 và 3.8 cho thấy hàm lượng flavonoid glycosid còn lại phụ thuộc vào pH và nồng độ dinatri edetat, nồng độ natri metabisulfit.
Khi pH > 6,5 thì hàm lượng flavonoid glycosid còn lại giảm mạnh, đồng thời nồng độ dinatri edetat tăng làm giảm hàm lượng flavonoid glycosid còn lại, trong khi đó tăng nồng độ natri metabisulfit thì hàm lượng flavonoid glycosid còn lại tăng nhẹ.
Ngược lại khi pH < 6,5 thì hàm lượng flavonoid glycosid còn lại tăng nhẹ, đồng thời khi nồng độ dinatri edetat và nồng độ natri metabisulfit tăng làm tăng hàm lượng flavonoid glycosid còn lại. Điều này có thể giải thích là ở pH thích hợp, cơ chế tác dụng của chất chống oxy hóa. Dinatri edetat tạo phức với ion kim loại trong dung dịch mà các ion này là xúc tác cho các phản ứng oxy hóa cao ginkgo biloba, do vậy trong môi trường pH thích hợp pH< 6,5, khi tăng nồng độ dinatri edetat thì khả năng hiệp đồng chống oxy hóa tăng, giúp ổn định được dung dịch thuốc tiêm. Cơ chế chống oxy
Dinatri edetat (%) Natri metabisulfit (%)
Hàm lượng flavonoid glycosid còn lại (%)
55
hóa của natri metabisulfit là sinh SO2 khóa oxy hòa tan trong dung dịch thuốc, làm giảm hiện tượng oxy hóa cao ginkgo biloba, do vậy trong môi trường pH thích hợp, khi tăng nồng độ natri metabisulfit thì khả năng chống oxy hóa tăng, giúp ổn định được dung dịch thuốc tiêm.
Hình 3.8. Mặt đáp của Hàm lượng flavonoid glycosid còn lại theo nồng độ sorbitol, pH (Y2, X1, X3)khi dinatri edetat là 0,03% và natri metabisulfit là 0,2%
pH của dung dịch thuốc tiêm ảnh hưởng tới hàm lượng flavonoid glycosid còn lại. Khi pH càng tăng thì hàm lượng flavonoid glycosid còn lại càng giảm: với pH trong khoảng 6,9 đến 7,5 hàm lượng flavonoid glycosid còn lại giảm khá nhanh từ 98%
xuống 94%. Điều này có thể được giải thích là do khi pH càng tăng thì cao ginkgo biloba bị phân hủy nhiều hơn.
Sorbitol ảnh hưởng tới hàm lượng flavonoid glycosid còn lại trong mối quan hệ với pH. Khi pH dao động từ 6 đến 7,0 thì khi tăng nồng độ sorbitol đến 13%, hàm lượng flavonoid glycosid còn lại cũng tăng và khi tiếp tục tăng nồng độ sorbitol thì hàm lượng flavonoid glycosid còn lại lại giảm. Khi pH dao động từ 7,2 đến 7,5 thì khi tăng nồng độ sorbitol từ 10% đến 13%, hàm lượng flavonoid glycosid còn lại giảm dần
Sorbitol pH
Hàm lượng flavonoid glycosid còn lại (%)
56
và khi pH tăng từ 7,0 đến 7,5 thì hàm lượng flavonoid glycosid còn lại có xu hướng tăng nhẹ.
3.3.4. Lựa chọn công thức tối ưu 3.3.4.1.Kết quả tối ưu hóa
Từ kết quả 27 thí nghiệm sử dụng phương pháp tối ưu hóa bằng phần mềm INForm v3.1 tối ưu được các biến đầu vào như sau:
Bảng 3.22. Giá trị tối ưu cho các biến đầu vào trong xây dựng công thức thuốc tiêm ginkgo biloba
STT Biến đầu vào Giá trị tối ƣu
1 pH 6,37
2 Dinatri edetat (%) 0,01
3 Sorbitol (%) 11,81
4 Natri metabisulfit (%) 0,13
Kết quả dự đoán: Hàm lượng còn lại sau đun 8 giờ 98,06 %, ΔpH = 0,13.
Như vậy công thức thuốc tiêm ginkgo biloba được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu có thành phần như sau:
STT Thành phần % (khối lƣợng/thể tích)
1 Cao ginkgo biloba 0,35
2 Đường sorbitol 11,81
3 Dinatri edetat 0,01
4 Natri metabisulfit 0,13
5 2-pyrolidon 10
6 PG 20
57
7 Dinatri hydrophosphat 0,358
8 Acid hydrocloric 1N pH=6,37
9 Nước vđ 100 ml