1.1 Nguyeõn lieọu Dửụng cam cuực
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Dương cam cúc là cây thân thảo, hàng năm, mùi thơm đặc trưng, chiều cao khoảng 30- 60 cm, thân mọc thẳng đứng, phân cành nhiều. Lá mọc so le, xẻ 2-3 lần, hình lông chim rất sâu vào tận gân lá thành những mảng rất hẹp giống như những cây kim. Cụm hoa hình đầu nằm ở ngọn các cuống mảnh, đường kính của đầu hoa là 1-1,5 cm [2]. Dương cam cúc là loại thụ phấn chéo (thụ phấn tự do) [81]. Sự khác nhau về đặc điểm thực vật, đặc biệt là cấu trúc hoa của 2 loài DCC cũng được nhiều tài liệu đề cập [11], [72].
1.1.3 ẹieàu kieọn gieo troàng
Điều kiện gieo trồng là một vấn đề được các nước trồng DCC có mục đích sản xuất kinh doanh rất chú ý nghiên cứu vì điều này quyết định rất lớn đến sản lượng và chất lượng của hoa.
Dương cam cúc được trồng từ hạt. Giống cây này thích hợp với nhiều loại đất như đất bùn, đất mặn, đất đầm lầy và ngay cả đất sét, đất khô cằn. Các yếu tố
hóa, lý, sinh học, đất trồng, các yếu tố môi trường như nhiệt độ, không khí, điều kiện chiếu sáng, độ ẩm, chất dinh dưỡng, phân bón có tác động đến sự tích lũy hoạt chất trong hoa [30], [61], [81], [87].
Tại Việt Nam, Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã áp dụng thành công kỹ thuật trồng DCC bằng hạt trên các vùng đất đồi Đà Lạt với qui mô nhỏ khoảng 1000-2000 m2 chủ yếu để giữ giống và chỉ cung cấp cho một số nơi làm hương liệu trà [25].
1.1.4 Thành phần hóa học
Chủ yếu gồm tinh dầu và các polyphenol.
1.1.4.1 Tinh daàu Dửụng cam cuực
Thành phần - Hàm lượng tinh dầuDương cam cúc
Tinh dầu DCC tích lũy nhiều trong đế hoa và bầu hoa. Hàm lượng tinh dầu khoảng 0,2-1,5%. Tinh dầu có màu xanh dương do thành phần quan trọng là chamazulen được tạo thành từ sự biến đổi lacton sesquiterpen là matricin trong quá trình gia nhiệt (hình 1.3) [2], [89].
Hàm lượng chamazulen của các loại DCC khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng. Tác giả Falzari và Menary [55] đã dùng kỹ thuật GC/MS xác định được 10 thành phần chính trong tinh dầu DCC là β- farnesen, germacren-D, bicyclogermacren, α-farnesen, bisabolol oxid B, bisabolon oxid, α-bisabolol, chamazulen, bisabolol oxid A và dicycloether (còn gọi là cis-spiroether, cis-bicycloether).
Tác giả Habersang cũng khẳng định rằng hoạt tính sinh học dựa vào hai thành phần chính là chamazulen và α-bisabolol [60]. Một số thành phần hóa học chính trong tinh dầu DCC được ghi ở hình 1.4.
Matricin
(Proazulen) Acid chamazulen carboxylic
- CH3COOH - H2O
- CO2
Hình 1.3 Sự biến đổi của matricin thành chamazulen Chamazulen
(7-Ethyl-1, 4-dimethylazulen, Dimethulen)
Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất hoa và chất lượng tinh dầu
Năng suất hoa thu hoạch và chất lượng tinh dầu tùy thuộc nhiều vào khí hậu, thổ nhưỡng, quốc gia… [81] được tóm tắt ở bảng 1.1.
c. α-bisabolol d. Chamazulen
CH2 C
H3
C H3
CH3 O O
a. Bisabolol oxid A b. Bisabolol oxid B
Hình 1.4 Công thức cấu tạo các thành phần hóa học chính trong tinh dầu Dương cam cúc
Bảng 1.1 So sánh năng suất hoa, chất lượng tinh dầu Dương cam cúc của một số nước.
STT Vùng, quốc gia Hàm lượng (%) tinh daàu
Hàm lượng (%) bisabolol oxid A, B
Hàm lượng (%) chamazulen
Naêng suaát hoa DCC (kg/ha) 1 Transdanubia 0,56 – 0,69 34 - 43 1,0 - 1,5 500 – 800 2 Ukraine 0,25 – 0,28 40 - 45 4,5 - 5,4 500 – 700 3 Slovenia 0,21 – 0,25 38 - 42 3,5 - 5 400 – 500 4 Ai cập 0,35 – 0,45 45 - 53 1,7 - 2 400 – 450 5 Nepal 0,34 – 0,96 32 - 38 1,5 - 2,4 400 – 500 6 UÙc 0,34 – 0,71 45 - 50 2,3 - 4,3 500 – 600 7 YÙ 0,43 – 0,68 40 - 44 < 0,5 450 – 550
Hàm lượng tinh dầu thường biến đổi theo thời điểm thu hoạch, cách sơ chế và phương pháp bảo quản hoa.
Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch hoa Dương cam cúc
Thời điểm thu hoạch đúng được xác định dựa trên chỉ số FMI. Hoa được phân làm 6 giai đoạn: Giai đoạn 1 - chồi hoa (buds), giai đoạn 2 - nụ hoa hé mở (rays opening), giai đoạn 3 - hoa bắt đầu nở (disc opening), giai đoạn 4 - hoa nở (50% of disc florets open), giai đoạn 5 - hoa nở rộ (100% of disc florets open), giai đoạn 6 - hoa đang tàn (flower senescing)
FMI flowerstagei Ni trong đó N
i
*
6
∑=1
= i là số hoa ở giai đoạn i [55].
Tỷ lệ của FMI trong từng giai đoạn là số hoa nhân với số thứ tự giai đoạn rồi chia cho FMI tổng số. Hoa trưởng thành ở các mức độ khác nhau nên cùng một lúc hoa sẽ ở nhiều giai đoạn. Vì đặc tính này nên hoa DCC thường được thu hoạch nhiều đợt thay vì chỉ một đợt. Một thử nghiệm khác đã phát hiện ra việc tích lũy chamazulen và bisabolol của hoa đặc biệt tăng dần và nhiều nhất ở giai đoạn 3 rồi giảm dần ở giai đoạn 4 trở đi [55].
Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản hoa Dương cam cúc
Để bảo quản hoa sau thu hoạch được tốt, các thử nghiệm được tiến hành trên các mẫu hoa tươi, hoa đông lạnh, hoa sấy khô ở 30 oC. Các mẫu trên được xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước và các thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí. Thí nghiệm khác đã kiểm tra các thành phần thay đổi trong tinh dầu, mức độ α-farnesen của hoa đông lạnh thấp hơn nhiều so với hoa tươi, bicyclogermacren giảm 2,2% trong hoa đông lạnh, 1,7% trong hoa khô và 0,35% trong hoa tươi, chamazulen trong hoa khô có hàm lượng cao nhất. Việc lưu giữ trong 6 tháng ở nhiệt độ phòng làm giảm hàm lượng hoạt chất hoa [55].
Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã bảo quản hoa khô bằng bao nylon dày hàn kín, bên ngoài là bao lát tránh ánh sáng.
Định tính - Định lượng tinh dầu Dương cam cúc
Các phương pháp định tính, định lượng tinh dầu DCC được đề cập trong USP, BP, Eu Phar. [38], [52], [53], [92], [93], [94].
Định tính bằng phản ứng hóa học
Định tính tinh dầu DCC với thuốc thử dimethylaminobenzaldehyd trong hỗn hợp acid phosphoric, acid acetic và nước, quan sát sự thay đổi màu trong lớp dung môi hữu cơ (hexan, petroleum) [92], [93].
Định tính, định lượng bằng sắc ký khí
Ứng dụng sắc ký khí để xác định thành phần, hàm lượng các chất chính của tinh dầu DCC [14], [24], [49], [63]. Tác giả Levy J.M, Storozynsky E. đã sử dụng detector ion hóa ngọn lửa, khí mang là nitrogen hay helium, cột sắc ký vật liệu là silica nung chảy dài 30-60 m (có thể sử dụng bề dày màng phim khoảng 1-2 μm, đường kính 0,25-0,53 mm, điều chỉnh nhiệt độ phù hợp), tốc độ dòng 1-2
ml/phút, tiêm mẫu 1 μl. Mẫu được pha loãng trong cyclohexan [67].
Dựa trên các đỉnh và thời gian lưu thu được của α–bisabolol và chamazulen trong sắc ký đồ của mẫu thử so với sắc ký đồ của mẫu chuẩn [28], [51], [94].
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Bảng 1.2 So sánh định tính tinh dầu theo USP 25 và BP 2005
USP 25 BP 2005
Dung dịch thử Tinh dầu trong toluen
Dung dũch chuaồn Borneol, bornyl acetat, guaiazulen trong toluen
Dung moõi khai trieồn Cloroform Ethyl acetat-toluen (5:95) Thuốc thử phát hiện Anisaldehyd
Quan sát Ánh sáng thường
Sắc ký đồ (SKLM) SKĐ chuẩn có 3 vết tương ứng là guaiazulen, bornyl acetat, borneol.
SKĐ mẫu thử có 5-7 vết trong đó 3 vết có Rf và màu sắc tương tự SKĐ mẫu chuẩn.
Định tính tinh dầu DCC bằng sắc ký lớp mỏng trong BP, USP đều có điều kiện và kết quả gần như tương tự nhau [38], [93].
1.1.4.2 Flavonoid cuỷa hoa Dửụng cam cuực Thành phần flavonoid
Fabiana phân tích thành phần dịch chiết hoa DCC, xác định được 11 hợp chaát phenolic goàm coumarin (herniarin, umbellieron), phenylpropanoid (chlorogenic acid, caffeic acid), flavon (apigenin, apigenin-7-o-glucosid, luteolin, luteo-7-o-glucosid), flavonol (quercetin, rutin), flavonon (narigenin) [54].
Công thức cấu tạo của một số thành phần hoá học chính trong DCC được trình bày ở hình 1.5.
O OH O
H
O H
OH O
OH
O O
OH
O O
H
OH
OH O f. Apigenin e. Apigenin-7-glucosid
Định tính – Định lượng flavonoid của hoa Dương cam cúc Hình 1.5 Công thức cấu tạo flavonoid chính trong Dương cam cúc
Phương pháp định tính, định lượng được đề cập trong USP, BP, Eu Phar.
Định tính bằng phản ứng hóa học
Định tính thành phần flavonoid trong dịch chiết bằng thuốc thử chung [19].
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Bảng 1.3 so sánh định tính flavonoid theo BP 2005, Eu Phar 2002 [38], [52].
Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng trong các BP, Eu Phar có điều kiện khác nhau. Trong USP không thấy đề cập đến phương pháp này.
Bảng 1.3 So sánh định tính flavonoid theo BP 2005 và Eu Phar 2002
BP 2005 EuPhar 2002
Dung dịch thử Dịch chiết methanol
Dung dũch chuaồn Clorogenic acid, hyperoxid,
rutin trong methanol Apigenin, apigenin-7-glucosid trong methanol
Dung moâi khai trieồn
Acid formic khan-acid acetic băng-nước-ethyl acetat (7,5:7,5:18,67)
Acid acetic băng-nước-butanol (17:17:66)
Thuốc thử phát
hieọn Diphenyl boric acid amino ethyl ester trong methanol Dung dòch macrogol 400 trong methanol
Quan sát UV 365 nm
Sắc ký đồ (SKLM)
SKĐ chuẩn có 3 vết.
SKĐ thử có các vết tương ứng, thêm các vết màu xanh lá phát quang phía trên vết màu vàng nâu
SKĐ chuẩn có vết phía trên là apigenin, vết giữa là apigenin-7- glucosid.
SKĐ thử có nhiều vết trong đó có 2 veỏt tửụng ủửụng maóu chuaồn
Định tính, định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (SKLHNC)
Ứng dụng phương pháp này để định tính những hợp chất flavonoid trong dịch chiết DCC qua thời gian lưu các mẫu khảo sát so với mẫu đối chiếu [16].
Trong USP, BP đã định lượng apigenin-7-glucosid dựa vào diện tích hay chiều cao đỉnh của mẫu khảo sát so với mẫu chuẩn trong điều kiện thực nghiệm.
Dùng hệ thống sắc ký có bộ phận phát hiện ở bước sóng 335 nm, cột 125 mm x 4 mm, tốc độ dòng 1 ml/phút. Pha động sử dụng hỗn hợp khác nhau gồm dung dịch kali hydro phosphat 0,005M, điều chỉnh bằng dung dịch acid phosphoric loãng đến pH = 2,55 ± 0,1 và hỗn hợp acetonitril-methanol (65:35) trong hệ thống sắc kyù [45], [53], [68], [73], [92].
Phân lập, tinh chế apigenin, apigenin-7-o-glucosid bằng sắc ký cột Phương pháp phân lập
Phân lập riêng từng flavonoid như apigenin, apigenin-7-o-glucosid [33]
bằng phương pháp SKC với chất hấp phụ polyamid, cellulose, silicagel… Để thu được flavonoid tinh khiết cần phải SKC vài lần hay dùng sắc ký chế hóa.
Svehelikova, V., Redaeli, C. [82], [95] đã phân lập, tinh chế và nghiên cứu tính ổn định các dẫn xuất acetyl hóa của apigenin-7-o-glucosid từ hoa DCC Đức bằng cách kết hợp chiết pha rắn polyamid và SKLHNC. Qua kết quả LC/MS và dữ liệu NMR của các glucosid, chất được xác định là apigenin-7-o-glucosid.
Một số phương pháp tinh chế
Phương pháp kết tinh lại: Áp dụng đối với hợp chất rắn có thể hoà tan một dung môi hay hỗn hợp dung môi ở nhiệt độ cao.
Phương pháp tinh chế dịch chiết từ dược liệu bằng SKC.
Phương pháp dùng dung môi: Dùng một hay hỗn hợp nhiều dung môi để
tách chiết, tinh chế hoạt chất dựa vào độ hoà tan và phân bố khác nhau của các chất trong các dung môi [24].
Phương pháp phân tích bằng quang phổ
Dùng quang phổ tử ngoại, quang phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân [15], [37], [82] để đánh giá cấu trúc chất phân lập.
1.1.5 Tác dụng dược lý và công dụng 1.1.5.1 Tác dụng dược lý
Cao DCC và α-bisabolol đều có hoạt tính hạ sốt. Cao nước - cồn DCC ức chế sự phát triển in vitro của Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Leptospira icterohemorrhagiae, Strepsalivarius, Bacillus megatherium. Tinh daàu DCC ức chế in vitro Staph. aureus, Bacillus subtilis, ức chế vi khuẩn gram dương mạnh hơn so với vi khuẩn gram âm, ức chế mốc và nấm da thử nghiệm.
Cao DCC ức chế in vitro cả cyclooxygenase và lipoxygenase và do đó ức chế sự sản sinh prostaglandin và leukotrien là những chất gây viêm đã được biết.
Bisabolol và bisabolol oxid đã được chứng minh là có tác dụng ức chế 5 - lipoxygenase nhưng bisabolol có tác dụng mạnh hơn [2].
Tác dụng chống viêm của các hợp chất đã được chứng minh trên những mô hình thí nghiệm ở các động vật khác nhau (gây phù bàn chân chuột cống trắng với carrageenin, gây viêm da bằng dầu bã đậu ở chuột nhắt trắng). Cao toàn phần DCC và phân đoạn flavonoid có hiệu quả giảm viêm khi dùng tại chỗ [2].
Các chế phẩm DCC được chứng minh có hiệu quả trong điều trị viêm niêm mạc do chiếu tia ở đầu và cổ, do liệu pháp hóa học toàn thân [2], [74]. Kobayashi Y. chứng minh tinh dầu DCC có tác dụng ngăn chặn kích ứng da là do bisabolol oxid A [81]. DCC có tác dụng tốt trong điều trị viêm, loét miệng [70].