Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thẩm định tên khoa học và xây dựng tiêu chuẩn Dương cam cúc
2.2.1.2 Veà hoa khoõ Dửụng cam cuực
Bột soi: Hoa khô được tán và qua rây số 32. Quan sát trong nước hay dung dịch thuốc thử glycerin hoặc sau khi nhuộm kép. Kết quả được chụp hình.
Thành phần hoá học của hoa khô Dương cam cúc Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học
Áp dụng phương pháp của bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. HCM (cải tiến từ phương pháp của Đại học Dược khoa Rumani [6]).
Tinh daàu Dửụng cam cuực
ẹũnh tớnh tinh daàu Dửụng cam cuực - Định tính bằng phản ứng hóa học
+ Chuẩn bị mẫu: Lấy 30 g bột hoa khô DCC cho vào bình chưng cất 1000 ml, thêm 250 ml nước cất chưng cất trong 3 giờ ở tốc độ 3 - 4 ml/phút, hứng lấy tinh dầu, gạn, làm khan (dịch A) [92], [52].
+ Lấy 0,1 ml dịch A cho vào ống nghiệm, thêm 2,5 ml dung dịch (gồm 0,25 g dimethylaminobenzaldehyd hoà trong 5ml acid phosphoric, 45 ml acid acetic, 45 ml nước cất), đun cách thuỷ 2 phút và làm lạnh. Thêm 5 ml hexan/petroleum và lắc nhẹ. Yêu cầu xuất hiện một lớp ngăn cách rõ có màu xanh [92].
- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng + Chuaồn bũ maóu:
Dung dịch thử: Hoà tan 20 μl tinh dầu (dịch A) vào 1 ml toluen.
Dung dịch chuẩn: Hòa tan 1 mg borneol, 10 mg bornylacetat và 2 mg guaiazulen.
Chất hấp phụ: Silica gel F254 bản nhôm tráng sẵn 0,25 mm.
Heọ dung moõi khai trieồn: Ethyl acetat –toluen (5:95).
+ Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 μl mỗi dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Sau khi triển khai bản mỏng, để bay hơi hết dung môi. Sau đó phun thuốc thử anisaldehyd, để khô. Sấy 105-110 oC trong 5-10 phút.
Quan sát dưới ánh sáng thường. Yêu cầu trên sắc ký đồ, mẫu thử phải có các vết có cùng Rf và màu sắc tương ứng với các vết trên mẫu chuẩn [20], [92].
Xác định hàm lượng tinh dầu Dương cam cúc bằng cất kéo hơi nước
Xác định hàm lượng tinh dầu trong hoa khô Dương cam cúc bằng phương pháp cất kéo hơi nước. Mẫu khảo sát là các mẫu thu hoạch mùa khô từ năm 2005-2009, mỗi mùa lấy 3 mẫu để khảo sát.
- Lấy 100 g bột hoa khô DCC cho vào bình chưng cất dung tích 3 lít, thêm 500 ml nước cất, chưng cất 4 giờ với tỷ lệ 3-4 ml/phút, gạn tinh dầu, làm khan,
xác định hàm lượng tinh dầu thu được.
Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu khô được tính theo công thức:
%) (
% 100
a m m T V
×
−
= ×
Trong đó m: Khối lượng dược liệu (g), a: Độ ẩm dược liệu (%), V: Thể tích tinh daàu (ml) [6],[55], [92].
Khảo sát chất lượng tinh dầu Dương cam cúc theo thời điểm hoa nở, mùa thu hoạch, cách sơ chế, bảo quản
- Theo thời điểm hoa nở: Xác định hàm lượng tinh dầu cao nhất (bằng phương pháp cất kéo hơi nước) theo giai đoạn trưởng thành của hoa.
- Theo mùa thu hoạch: So sánh hàm lượng tinh dầu và hàm lượng bisabolol oxid A, B (bằng phương pháp CO2 SCF) vào hai mùa mưa và khô vào các năm 2004-2009.
- Theo cách sơ chế: Theo dõi cảm quan, hàm lượng tinh dầu của hoa (bằng CO2 SCF) ở các điều kiện chế biến khác nhau. Phơi nắng đến khô (độ ẩm 10 ± 2
%), phơi nắng đến ráo rồi sấy ở 45 oC đến khô, sấy 60 C đến khô [2], [25]. o
- Theo điều kiện bảo quản: Theo dõi cảm quan, hàm lượng tinh dầu của hoa (bằng CO2 SCF) ở các điều kiện bảo quản khác nhau. Nhiệt độ phòng, bao bì bình thường; nhiệt độ phòng, bao bì có lớp chống ẩm; nhiệt độ 25 oC, độ ẩm ≤ 75%, bao bì bình thường; bảo quản trong dụng cụ có hơi ethanol bão hòa [25].
Flavonoid trong hoa khoõ Dửụng cam cuực ẹũnh tớnh flavonoid
- Định tính bằng phản ứng hoá học
+ Chuẩn bị mẫu: Lấy 1 g bột hoa cho vào 20 ml methanol, đun cách thủy ở 60 oC trong 10 phút, để nguội và lọc (dịch B) [6], [52].
+ Tiến hành: Bằng phản ứng hóa học theo thuốc thử chung nhóm flavonoid.
- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng + Chuaồn bũ maóu:
Dung dịch thử: Dịch B.
Dung dịch chuẩn: Hoà tan 2,5 mg apigenin-7-glucosid/10 ml methanol.
Chất hấp phụ: Silica gel F254 bản nhôm tráng sẵn 0,25 mm.
+ Hệ dung môi khai triển: Ethyl acetat- methanol- nước (100:17:13).
+ Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 μl mỗi dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Sau khi triển khai bản mỏng, để bay hơi hết dung môi.
Thuốc thử phát hiện kali hydroxid trong ethanol 96%, kiểm tra dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm.
+ Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, mẫu thử phải có các vết có cùng Rf và màu sắc tương ứng với các vết có trên sắc ký đồ mẫu chuẩn [20], [52].
Định lượng flavonoid toàn phần, apigenin-7-glucosid trong Dương cam cúc - Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp cân
+ Tiến hành: Cân chính xác khoảng 10 g bột hoa khô (độ ẩm 10%). Chiết bằng 50 ml methanol trong Soxhlet. Thu hồi dung môi, cô cách thuỷ đến khô.
Hoà tan cắn với 20 ml nước nóng, 2 lần. Chiết bằng ethyl acetat nhiều lần, mỗi lần khoảng 7 ml cho đến khi dịch ethyl acetat không còn phản ứng của flavonoid (cyanidin). Gộp chung các dịch chiết ethyl acetat. Bốc hơi ethyl acetat đến khô.
Sấy ở 105 oC trong 3 giờ. Cho vào bình hút ẩm. Cân và tính tỷ lệ phần trăm flavonoid TP [6].
+ Tính kết quả: Tỷ lệ phần trăm hàm lượng flavonoid TP theo công thức f: Khối lượng cắn ethyl acetat (g)
m F 100f
(%)= m: Khối lượng dược liệu khô tuyệt đối (g).
- Định lượng apigenin-7-glucosid trong hoa bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tiến hành thẩm định qui trình định lượng để xem phương pháp có đáp ứng được yêu cầu xác định hàm lượng của thành phần chính có trong mẫu thử.
+ Chuaồn bũ maóu
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg apigenin-7-glucosid chuẩn, cho vào bình định mức 50ml, hoà tan trong khoảng 35 ml methanol vừa đủ thể tích, lắc đều. Lấy chính xác 5 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml, thêm hỗn hợp methanol- nước (1:1) (dịch C). Từ dịch C, pha một dãy gồm 5 nồng độ apigenin-7-glucosid chuẩn (5, 15, 25, 50, 75 μg/ml) trong hỗn hợp methanol- nước (1:1) [92].
Dung dịch thử: Mẫu hoa DCC, cân chính xác khoảng 1,5 g cho vào bộ chiết Soxhlet và chiết bằng methanol trong vòng 24 giờ, sau đó cho dung dịch methanol vào bình định mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ thể tích. Lấy chính xác 5 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml, thêm hỗn hợp methanol- nước (1:1) lắc đều. Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 μm.
+ Điều kiện sắc ký: Cột Gimini C18, 250 x 4,6 mm: 5 μm; pha động: Dung dũch I: Dung dũch kali dihydrophosphat 5 mM. Chổnh veà pH 2,5 baống acid phosphoric; dung dịch II: Hỗn hợp acetonitril và methanol tỷ lệ 65/35. Sử dụng chương trình gradient (bảng 2.6), tỷ lệ các dung dịch có thể thay đổi nếu cần.
Nhiệt độ cột: 40 oC; detector: Photodiode array; bước sóng phát hiện: 335 nm.
Bảng 2.6 Chương trình gradient chạy sắc ký định lượng apigenin-7-glucosid trong hoa Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml) Dung dịch I (%) Dung dịch II (%) 0,00 1,0 80 20
20,0 1,0 80 20 25,0 1,0 76 24 30,0 1,0 76 24 35,0 1,0 70 30 40,0 1,0 80 20 45,0 1,0 80 20
+ Tiến hành: Lần lượt tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống.
+ Kết quả: Nồng độ apigenin-7-glucosid trong dược liệu DCC được tính dựa trên đường tuyến tính của dung dịch apigenin-7-glucosid chuẩn suy ra nồng độ của apigenin-7-glucosid có trong dung dịch thử.
+ Đánh giá tính phù hợp của hệ thống
Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn theo mục 2.2.1.2, bơm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, mỗi mẫu bơm 6 lần. Khảo sát tính tương thích hệ thống dựa vào kết quả tính RSD của các thông số diện tích đỉnh, thời gian lưu… [16].
+ Đánh giá qui trình định lượng apigenin-7-glucosid trong nguyên liệu
• Khảo sát tính đặc hiệu: Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch thử thêm chuẩn apigenin-7-glucosid. Khảo sát phổ UV-Vis của đỉnh apigenin-7-glucosid trong hai dung dòch treân.
• Khảo sát tính tuyến tính: Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn
theo mục 2.2.1.2, khảo sát sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh. Xác định phương trình hồi qui và hệ số tương quan R2.
• Khảo sát độ lặp lại: Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn theo mục 2.2.1.2, thực hiện trên 6 mẫu, bơm lần lượt các mẫu thử vào hệ thống SKLHNC, tính RSD và so sánh theo qui định của tài liệu tham khảo [7], [42], [69] để khảo sát độ chính xác của phương pháp.
• Khảo sát độ đúng: Thực hiện theo phương pháp thêm chuẩn 80%, 100%, 120% so với nồng độ apigenin-7-glucosid có trong mẫu thử, sao cho tổng nồng độ apigenin-7-glucosid nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Mỗi mẫu thực hiện 3 laăn. Tớnh tyỷ leụ phỳc hoăi cụa moời tyỷ leụ chaẫt chuaơn theđm vaứo vaứ so saựnh theo qui định của tài liệu tham khảo [7], [42], [50], [69].
Phân lập và tinh chế apigenin-7-glucosid làm chất đối chiếu - Chiết xuất, phân lập và tinh chế flavonoid từ cao khô
Lấy 15 kg hoa DCC khô (đã chiết tinh dầu bằng phương pháp CO2 SCF) đem chiết theo qui trình điều chế cao bằng PP đun hồi lưu ở mục 2.2.2.2 và thu được dịch chiết. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến thể chất theo yêu cầu và tiến hành loại tạp bằng ethanol 90%, để lắng, lọc qua thiết bị lọc có đường kính lỗ lọc khoảng 500 μm để loại các thành phần không tan, phun sấy dịch thu được cao khô.
Lấy 100 g cao khô hòa với 500 ml nước nóng, để nguội, lắc với ethyl acetat nhiều lần, mỗi lần với 200-250 ml, gộp dịch chiết ethyl acetat, cất thu hồi dung môi bằng cất cô quay thu được một chất rắn. Tiến hành SKC nhanh bằng cột silica gel 60 (F254), 0,063-0,2 mm. Nạp cột dạng hỗn dịch, nạp mẫu vào cột, hệ dung môi để rửa giải hấp phụ là ethyl acetat- methanol với sự tăng dần tỷ lệ methanol từ 0-80% với tốc độ 10 ml/phút, mỗi phân đoạn 20 ml. Theo dõi thành phần các flavonoid từ các dịch rửa giải thu được bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat- methanol- nước (100:17:13), phát hiện bằng cách soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Các dịch rửa giải với hệ dung môi có tỷ lệ ethyl acetat- methanol (80:20) được phân tích tiếp bằng SKC silica gel như trên lần hai. Gộp chung các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau (bằng SKLM chỉ cho một vết). Cô đến cắn và tái kết tinh trong methanol thu được hợp chất kết tinh có màu vàng nhạt. Sấy sản phẩm trong tủ sấy chân không ở 50 oC đến khối lượng không đổi (mẫu chất phân lập) [13], [14], [24].
- Xác định tính chất vật lý của chất phân lập + Tính chất cảm quan màu sắc, mùi vị.
+ Tính tan bằng phương pháp hòa tan trong một số dung môi khác nhau.
+ Điểm chảy bằng phương pháp mao quản [14], [24].
+ Xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập.
Tiến hành nhận dạng cấu trúc của chất phân lập được bằng đo phổ UV-Vis, phổ IR, phổ MS, phổ 1H NMR và 13C NMR[15], [37].
Quá trình biện giải phổ của mẫu phân lập theo tài liệu [37], [82].
Xác định độ ẩm, độ tro, tỷ lệ vụn nát của hoa khô Dương cam cúc - Xác định độ ẩm: Theo phụ lục 9.6 DĐVN IV [20].
- Xác định độ tro toàn phần: Theo phụ lục 9.8 DĐVN IV [20].
- Xác định tỷ lệ vụn nát: Theo phụ lục 12.12 DĐVN IV [20].
Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và kiểm nghiệm cho Dương cam cúc Xây dựng tiêu chuẩn hoa khô Dương cam cúc
Tiêu chuẩn được xây dựng dựa trên các kết quả thu được bao gồm đặc điểm vi học, các chỉ tiêu cảm quan của dược liệu, các chỉ tiêu định tính và định lượng, chỉ tiêu an toàn [6].
Kieồm nghieọm hoa khoõ Dửụng cam cuực
Cây hoa và hoa khô DCC được kiểm nghiệm phải đạt theo TCCS.
Xây dựng tiêu chuẩn chất phân lập apigenin-7-glucosid
- Để chất phân lập có thể làm chất đối chiếu hóa học phải đánh giá so sánh với chất chuẩn quốc tế là apigenin-7-glucosid (USP), hàm lượng 100%.
- Phương pháp được Viện kiểm nghiệm thuốc TP. HCM thẩm định theo tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng cho chất phân lập apigenin-7-glucosid gồm: Mô tả, định tính bằng phổ hồng ngoại và sắc ký lỏng hiệu năng cao, định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, bảo quản [22].
Kiểm nghiệm chất phân lập apigenin-7-glucosid
Chất phân lập apigenin-7-glucosid được kiểm nghiệm phải đạt theo TCCS.