Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.3 Bào chế kem thuốc và gel mỹ phẩm
2.2.3.1 Bào chế kem thuốc
Bào chế kem thuốc ở qui mô phòng thí nghiệm Xây dựng công thức
Chọn hệ tá dược:
- Khảo sát hai hệ tá dược A, B.
+ Hệ A gồm các tá dược thông thường đã được dùng phổ biến trong dạng kem, chất nhũ hóa diện hoạt tween 80 trong hệ A tạo kem kiểu nhũ tương D/N.
+ Hệ B gồm các tá dược mới là dẫn chất của dầu oliu, chất nhũ hoá trong hệ B kết hợp tween 80 và olivem 1000 trong đó olivem 1000 là chất tự nhũ hoá có khả năng tạo mạng tinh thể, dầu không bị bao bọc mà được giữ trong các mắt lưới của hệ thống tạo nhũ tương D/N.
- So sánh hai hệ tá dược
+ Nghiên cứu sẽ so sánh hai hệ tá dược về tính an toàn trên da và khả năng giải phóng hoạt chất để chọn ra hệ mong muốn.
+ Hai hệ tá dược được phối hợp với hoạt chất thành các thuốc thử nghiệm ở Hệ tá dược B
Olivem 1000 3 g Chaỏt oồn ủũnh 2 g Crodamol 2 g Propylen glycol 2 g Tween 80 1 g
Nước tinh khiết vđ 100 g Hệ tá dược A
Cetyl alcohol 4 g Sáp ong 1 g Daàu parafin 10 g Glycerin 5 g Tween 80 2 g
Nước tinh khiết vđ 100 g
hai liều khác nhau liều 1(thuốc L1), liều 2 (thuốc L2) để tiến hành khảo sát.
Bảng 2.7 Hàm lượng hoạt chất phối hợp với hai hệ tá dược Hoạt chất Liều 1 Liều 2
Tinh daàu DCC (%) 0,1 0,3 Cao DCC (%) 0,5 1,5
+ Tiến hành gây viêm bằng mô hình gây phù bàn chân chuột và khảo sát hoạt tính kháng viêm của hai hệ tá dược không hoạt chất và có hoạt chất.
+ Dựa trên kết quả kháng viêm của hai hệ tá dược không hoạt chất và có hoạt chất sẽ chọn ra hệ theo tiêu chuẩn không gây kích ứng da, giải phóng hoạt chất tốt dựa vào khả năng làm giảm độ sưng phù chân chuột [1], [6].
- Moâ hình gaây vieâm
+ Gaõy phuứ baống carrageenin 1%
• Trước khi gây viêm, tiến hành đo thể tích chân chuột bình thường (V0).
Nắm giữ chuột trên một bàn tay. Dùng bàn tay còn lại cầm kẹp, kẹp duỗi thẳng bàn chân chuột xuống để nhúng chân chuột vào dung dịch chống thấm đến khuỷu chân, chờ cho số chỉ thị ổn định, nhấn giữ bàn đạp, đọc thể tích hiển thị trên máy đo. Đo 3 lần liên tiếp và lấy số liệu trung bình thể tích chân chuột.
• Chuột được gây viêm bằng cách tiêm dưới da vào gan bàn chân 0,025 ml dung dịch carrageenin 1%. Tiến hành đo thể tích chân chuột sau khi tiêm 3 giờ. Các chuột có thể tích chân sưng phù từ 60 - 100% so với bình thường được lựa chọn đưa vào thử nghiệm và chia đều vào các lô.
• Lô chứng chuột không được điều trị, các lô thử điều trị bằng thuốc thử.
• Theo dõi, đo thể tích chân chuột 3 giờ sau khi gây viêm và mỗi ngày (Vn) trong 6 ngày. Chuột được thoa thuốc 1 lần mỗi ngày ngay sau khi đo thể tích chaân [29].
Ngày 1 2 3 4 5 6
Đo kích thước bàn chân chuột sau 3 giờ, trong 6 ngày Bôi thuốc thử
Tieâm carrageenin 1%
Sơ đồ 2.2 Khảo sát tác dụng chống viêm trên chuột gây phù bằng carrageenin + Đánh giá kết quả
• Tác dụng kháng viêm được đánh giá dựa vào mức độ sưng phù của chân chuột vào các ngày và được tính theo công thức sau:
100
0 0 ×
= − V
V X Vn
Trong đó X: Độ sưng phù tính theo %; Vn: Thể tích chân chuột sau khi gây viêm (1/100 ml) có điều trị; Vo: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm (1/100 ml).
• Tác dụng ức chế phù (tác dụng kháng viêm) được biểu thị bằng tỷ lệ % giảm mức độ tăng thể tích bàn chân của lô chuột thử thuốc so với mức độ tăng của lô chứng và được tính theo công thức
X%chứng –
X%thử
Y % = X 100
X%chứng
Y% là tác dụng kháng viêm, X%chứng là tỷ lệ % tăng kích thước bàn chân chuột lô chứng, X% là tỷ lệ % tăng kích thước bàn chân chuột lô thử.
nh giá sự khác nhau giữa các lô. P < 0,05 được cho là có ý nghĩa thống kê.
Phương pháp bào chế kem thử nghiệm ở qui mô phòng thí nghiệm
thử
• Kết quả được thể hiện ở dạng: (Số trung bình) ± SEM. Dữ liệu được xử lyù thoáng keâ baèng phaàn meàm thoáng keâ Minitab 14.0. Pheùp thoáng keâ Mann- Whitney được sử dụng để đá
- Công thức cơ bản kem gồm: Tinh dầu DCC 0,1-0,3%, cao DCC 0,5-1,5%, daàu N
ùu t2. Cuối cùng cho qua thiết bị làm mịn thuốc mỡ trong thời gian qui ủũnh
yếu tố đầy đủ và tiến
đến v [18].
ịnh: Thành phần và tỷ lệ tá dược, phương pháp bào chế, phửụ
g tinh daàu DCC (%).
hoá các thành ợc kem ổn định, phóng thích hoạt chất tốt nhấât.
y1: %
hiệt độ 2 pha khi phối hợp, tốc độ, thời gian đồng ghệ 1%, tá dược vđ 100%. Hệ tá dược được chọn lựa theo kết quả trên.
- Qui trình bào chế kem bằng phương pháp nhũ hố: Đun chảy pha dầu đến nhiệt độ 65 oC. Đun nóng pha nước đến 70 oC. Phối hợp pha dầu vào pha nước trong thiết bị đồng nhất hóa thuốc mỡ, khuấy trộn trong khoảng thời gian t1 nhất định và tốc độ v1 đã được nghiên cứu, làm nguội đến nhiệt độ khoảng 50 oC, thêm tinh dầu DCC và dầu Nghệ vào, khuấy trộn tiếp trong khoảng thời gian nghieõn cử
t3 [5], [58].
Tối ưu hoá công thức kem
- Xác định tỷ lệ hoạt chất trong công thức kem
Xác định tỷ lệ hoạt chất (tinh dầu DCC, cao DCC) phối hợp cho hiệu lực kháng viêm cao theo phương pháp bố trí thí nghiệm kiểu
ùng cực trị bằng phương pháp Box-Wilson [17], + Thông số tối ưu y: Tác dụng kháng viêm (%) + Các yếu tố cố đ
ng pháp đánh giá.
+ Các yếu tố khảo sát:
X1: Hàm lượng cao DCC (%), X2: Hàm lượn - Xác định tỷ lệ tá dược trong công thức kem
Sau khi chọn hệ tá dược và xác định tỷ lệ hoạt chất, tiến hành tối ưu phần tá dược để đư
+ Thoõng soỏ toỏi ửu:
apigenin-7-glucosid phóng thích sau 60 phút; y2: Thời gian tách lớp (phút).
+ Các yếu tố cố định: N
nhaát
X3: Tyỷ leọ % crodamol
ương trình hồi qui bậc nhaát,
chọn được công thức có độ phóng thích hoạt chất và độ be
của thí nghiệm đã được chọn trong phần tối ưu hoá t
ònh
lượn eo mục 2.2.1.2) [36].
nghieọm trong hóa và làm mịn- nguội.
+ Các yếu tố biến thiên khảo sát: Gồm 5 yếu tố
X1: Tyỷ leọ % olivem 1000; X2: Tyỷ leọ % chaỏt oồn ủũnh;
X4: Tyỷ leọ % tween 80; X5: Tyỷ leọ % propylen glycol.
+ Bố trí thí nghiệm theo kiểu yếu tố từng phần, tìm ph tiến tới vùng cực trị bằng phương pháp Box-Willson.
Qua tối ưu hoá sẽ lựa àn tốt và phù hợp nhất.
+ Bào chế kem thuốc theo công thức được chọn Làm 5 mẫu theo điều kiện
heo qui trình ở mục 2.2.3.1.
- Phương pháp đánh giá độ phóng thích hoạt chất của kem
Đánh giá bằng phương pháp khuếch tán qua màng bán thấm cellulose acetat. Tính độ phóng thích apigenin-7-glucosid (%) của kem: Cho dung dịch nhận là hỗn hợp methanol- nước (1:1) vào khoang tế bào khuếch tán tự chế có đường kính để đặt màng 2,5 cm, dung tích bình khuếch tán 19 ml. Đặt màng cellulose acetat có lỗ xốp 0,45 μm lên phía trên. Cân chính xác khoảng 3 g kem để thử nghiệm. Ổn định nhiệt độ ở 37 ± 1 oC. Đặt hệ thống lên máy khuấy từ có bộ phận ổn định nhiệt độ trong 60 phút. Lấy dung dịch thu được trên đem đi đ
g (định lượng apigenin-7-glucosid bằng SKLHNC th - Phương pháp đánh giá thời gian tách lớp của kem
Cân 1 g thuốc mỡ vào ly có mỏ 50 ml, thêm 15 ml nước cất, khuấy kỹ bằng máy khuấy từ. Chọn các ống nghiệm có đường kính trong bằng nhau. Chuyển toàn bộ lượng trong ly vừa được khuấy vào ống nghiệm. Đặt ống
cách
ồn định trạng thỏi, ủũnh
quan: Mô tả trạng thái, màu sắc, mùi vị, đánh giá sự đồng nhaát
ra khỏi tủ lạnh để yên ở nhiệt độ phòng trong
rong vòng 24 giờ (8 giờ/n
dịch lọc đem đo pH [19]. Trị soá cu
à SKLM.
gạn lấy dịch toluen (dịch D). Phần còn lại dùng để tiếp
thu dịch D, khuấy kỹ, lọc. Lấy dịch methanol làm phản ứng thuỷ nhiệt độ 60 oC. Ghi thời gian thuốc mỡ lắng được 0,5 cm.
Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng kem ở qui mô phòng thí nghiệm Xây dựng TCCS cho kem thuốc về cảm quan, pH, độ o
tính, định lượng, chỉ tiêu an toàn, độ kích ứng da như sau:
Hình thức cảm thực hiện [19].
Độ ổn định trạng thái: Khi lưu mẫu trong 24 giờ ở 10 ± 1 oC và 45 ± 2 oC.
Lấy 5 lọ kem để nguyên cả nắp cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 10 ± 1 oC trong vòng 24 giờ (8 giờ/ngày). Lấy mẫu thử
vòng 3 giờ và nhận xét trạng thái.
Lấy mẫu thử ở tủ lạnh cho vào tủ sấy nhiệt độ 45 ± 2 oC t gày). Lấy mẫu thử ra khỏi tủ sấy và nhận xét trạng thái.
pH: Cân chính xác 5 g chế phẩm vào một cốc có mỏ, thêm nước cất đun sôi để nguội đủ 50 ml, khuấy kỹ, lọc qua giấy lọc, lấy
ûa pH phải nằm trong giới hạn cho phép (6-8).
Định tính: Bằng phản ứng hoá học v - Định tính bằng phản ứng hóa học + ẹũnh tớnh tinh daàu DCC trong kem
• Dung dịch thử từ chế phẩm: Lấy 5 g kem cho vào cốc có mỏ 50 ml, thêm 15 ml toluen, khuaáy kyõ,
tuùc ủũnh tớnh flavonoid.
• Tiến hành: Theo mục 2.2.1.2.
+ ẹũnh tớnh flavonoid trong kem
• Dung dịch thử từ chế phẩm: Thêm 20 ml methanol vào phần còn lại của cheỏ phaồm sau khi
ủũnh tớnh (dũch E).
• Tiến hành: Theo mục 2.2.1.2.
+ ẹũnh tớnh curcumin cuỷa daàu ngheọ trong kem
• Dung dịch thử từ chế phẩm: Lấy 5 g kem, thêm vào 20 ml ethanol 96%,
phản ứng (dịch F).
ào ống nghiệm, thêm vài giọt acid sulfuric đậm đặc,
, thêm vài giọt dung dịch natri hydr
ành màu đỏ. Thêm 3 giọt
dung màu xanh đen.
DCC trong kem
1 mg borneol, 1 ml bornyl acetat và 0,4 ml guaia
dịch thử từ tinh dầu nguyên liệu: Hoà 10 μl tinh dầu nguyên liệu vào 1 ml
5 mm.
acetat- toluen (5:95).
lọc, lấy dịch lọc làm
• Tiến hành:
Lấy 1 ml dịch thử cho v dung dịch có màu tím đỏ.
Lấy 1 ml dịch thử cho vào ống nghiệm oxyd, dung dịch chuyển sang màu đỏ cam.
Nhỏ từng giọt dung dịch thử lên giấy lọc. Để khô, giấy lọc còn lại vết màu vàng. Tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch acid boric 5%, rồi acid hydrocloric 10%, làm vài lần và hơ nóng nhẹ cho khô, vết vàng chuyển th
dũch amoniac 10% seừ chuyeồn sang - Định tính bằng sắc ký lớp mỏng + ẹũnh tớnh tinh daàu
• Chuaồn bũ maóu:
Dung dịch chuẩn: Hòa zulen trong 1 ml toluen.
Dung toluen.
Dung dịch thử từ chế phẩm: Dịch D được làm đậm đặc.
• Chất hấp phụ: Silica gel F254 bản nhôm tráng sẵn 0,2
• Heọ dung moõi khai trieồn: Ethyl
• Tiến hành: Như mục 2.2.1.2.
+ ẹũnh tớnh flavonoid trong kem
methanol.
acetat, moãi laàn 2,5 ml. Laáy
cetat- methanol- nước (100:17:13).
n trong kem
l ethanol 96%, lọc.
mm.
ho các vết có cùng màu sắc và Rf tương ứng v à của dung dịch chuẩn.
Định lượng apigenin-7-glucosid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
• Chuaồn bũ maóu:
Dung dịch chuẩn: Hoà tan 1 mg apigenin-7-glucosid trong 5 ml Dung dịch thử từ cao DCC: Cao DCC hoà trong methanol, lọc.
Dung dịch thử từ chế phẩm: Lấy 10 ml dịch E, làm bay hơi hết methanol, hoà tan cắn với 10 ml nước nóng. Lắc với 5 ml ethyl
dịch ethyl acetat, bay hơi dung môi còn khoảng 2 ml.
• Chất hấp phụ: Silica gel F254 bản nhôm tráng sẵn 0,25 mm.
• Heọ dung moõi khai trieồn: Ethyl a
• Tiến hành: Theo mục 2.2.1.2.
+ ẹũnh tớnh curcumi
• Chuaồn bũ maóu:
Dung dịch chuẩn: Hoà tan 1 mg curcumin chuẩn trong 1 ml ethanol 96%.
Dung dịch thử từ dầu nghệ: 1 g dầu nghệ hoà trong 10 m Dung dịch thử từ chế phẩm: Dịch F được làm đậm đặc.
• Chất hấp phụ: Silica gel F254 bản nhôm tráng sẵn 0,25
• Heọ dung moõi khai trieồn: Cloroform- acid acetic (9:1).
• Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 μl mỗi dung dịch trên, sau khi triển khai bản mỏng, để bay hơi hết dung môi. Quan sát dưới ánh sáng thường, soi ánh sáng đèn UV 245 nm và 365 nm, phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol, để khô, sấy ở nhiệt độ 105-110 oC trong 5-10 phút.
Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải c ới sắc ký đo
Định lượng
- Điều kiện SKLHNC, tiến hành, kết quả, thẩm định qui trình định lượng:
Xem muùc 2.2.1.2.
- Dung dịch chuẩn: Xem mục 2.2.1.2 với chất chuẩn đối chiếu là apigenin-7- glucosid được đề tài phân lập và đạt TCCS.
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 3 g kem, thêm 6 ml benzen, lắc đều trong 10 phút bằng máy lắc ống nghiệm, loại bỏ dịch benzen, làm tương tự 3 lần.
Hòa tan phần kem còn lại với 20 ml hỗn hợp methanol- nước (1:1), mỗi lần 10 ml. Lọc lấy dịch, cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung vừa đủ thể tích. Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 μm [16].
Thử tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn của kem thuốc
Đánh giá tác dụng kháng viêm của kem theo mô hình gây phù chân chuột baèng formalin 2%.
Chuột được tiêm dưới da 0,02 ml formalin 2% vào gan bàn chân sau vào ngày thứ 1, thứ 3, thứ 5. Các lô chuột thử được bôi thuốc 30 phút sau khi tiêm formalin ở ngày 1, 3, 5 và lần thứ hai vào lúc 3 giờ chiều cùng ngày. Vào các ngày khác chuột được bôi thuốc thử 2 lần/ngày và liên tục trong 6 ngày. Đo kích thước chân chuột vào sáng ngày thứ 7 (sơ đồ 2.3).
Bôi thuốc thử
Đo kích thước bàn chân chuột Ngày 1 2 3 4 5 6
ngày thứ 7
Tieâm formalin 2%
Sơ đồ 2.3 Khảo sát tác dụng chống viêm trên chuột gây phù bằng formalin
Cách đo thể tích chân và thao tác gây viêm tương tự như gây phù bằng carrageenin 1%, chỉ khác nhau ở thời điểm gây viêm, đo và bôi thuốc thử.
Đánh giá sơ bộ tác dụng kháng khuẩn bằng cách xác định MIC theo phương pháp pha loãng trong môi trường rắn.
Tạo những bản thạch có chứa chất thử nghiệm với nồng độ tăng dần. Chấm 1 μl vi khuẩn thử nghiệm với nồng độ 106 vi khuẩn/ml lên các bản thạch. Sau khi ấp ở 37 oC trong 24 giờ, quan sát sự tăng trưởng vi khuẩn bằng mắt thường, nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất ngăn cản sự tăng trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường.
Các chỉ tiêu an toàn của kem thuốc: Thực hiện theo TCVN 6972-2001.
Chỉ tiêu kích ứng da: Thực hiện theo TCVN 6972-2001.
Kiểm nghiệm kem ở qui mô phòng thí nghiệm
Kem thuốc được kiểm nghiệm phải đạt theo TCCS. Dựa vào kết quả kiểm nghiệm, xác định công thức kem hoàn chỉnh để nâng cấp cỡ lô.
Bào chế kem thuốc ở qui mô pilot
Bào chế kem thử nghiệm thăm dò với cỡ lô 30 kg
Sau khi tối ưu hoá và tìm được công thức hoàn chỉnh của kem ở qui mô phòng thí nghiệm, tiếp tục nâng cấp cỡ lô lên khoảng 30 kg. Làm một lô thăm dò theo công thức tối ưu ở phòng thí nghiệm, sau đó nhận xét kem về thể chất (đẹp:
++, đạt: +, xấu: -) và độ bền so với mẫu trong phòng thí nghiệm.
Hiệu chỉnh các thông số
Từ kết quả so sánh trên, nếu kem thử nghiệm chưa đạt yêu cầu, tiếp tục nghiên cứu để hiệu chỉnh các thông số kỹ thuật trong qui trình sản xuất gồm nhiệt độ, thời gian nóng chảy pha dầu, tốc độ, thời gian đồng nhất hóa, làm mịn-nguội và các thông số thiết bị như thể tích bình chứa, kích thước cánh khuấy. Sau quá trình thăm dò, những thông số ít ảnh hưởng đến chất lượng kem được chọn và cố định, thông số có ảnh hưởng nhiều được xác định và kiểm soát trong nghiên cứu
nâng cấp. Mẫu của các thí nghiệm hiệu chỉnh được lấy mỗi thời điểm 5 mẫu ở 5 vị trí khác nhau gồm 4 góc và trung tâm trong thiết bị đồng nhất.
Từ các thông số kỹ thuật của sản phẩm thử nghiệm cuối đưa ra qui trình sản xuất kem ở qui mô pilot.
Kiểm nghiệm kem lô C1 được sản xuất ở qui mô pilot
Sản phẩm thử nghiệm cuối cùng để xác định các thông số cho qui trình sản xuất pilot là lô C1. Sản phẩm của lô C1 được kiểm tra các chỉ tiêu trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm kem thuốc gồm các chỉ tiêu lý, hóa như trong mục 2.2.3.1.
Nghiên cứu tính ổn định của qui trình sản xuất
Nếu C1 đạt tiếp tục làm thêm 2 lô liên tiếp C2, C3. So sánh các lô về độ phân tán hàm lượng, hàm lượng trung bình của apigenin-7-glucosid và độ bền trong 3 lô để xác định tính ổn định của qui trình sản xuất. Sản phẩm được dùng dể theo dõi độ ổn định kem của 3 lô C1, C2, C3.
Theo dõi độ ổn định của kem
Nghiên cứu độ ổn định được thực hiện trên 3 lô thử nghiệm liên tiếp của kem sản xuất ở qui mô pilot 30 kg/lô. Phương pháp xác định độ ổn định của sản phẩm được thực hiện ở điều kiện lão hóa cấp tốc trong 24 giờ ở 10 ± 1 oC và 45
± 2 oC (xem mục 2.2.3.1) và điều kiện nhiệt độ, độ ẩm bình thường là 30 ± 2 oC, 75 ± 5 (%). Ở điều kiện lão hóa cấp tốc trong 24 giờ, sản phẩm đạt khi kem không bị tách lớp. Phương pháp xác định tuổi thọ của kem chủ yếu được dựa trên kết quả khảo sát cảm quan và hàm lượng hoạt chất chính (apigenin-7-glucosid) sau thời gian mỗi 3 tháng trong năm đầu tiên và cách mỗi 6 tháng trong những năm tiếp theo. Nghiên cứu đã theo dõi sản phẩm ở các thời điểm 3, 6, 9, 12, 18 tháng [9], [32].