Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tỉ lệ nhiễm và loài sán lá gan nhỏ ở người và ở cá nước ngọt nuôi tại thị
3.1.3. Xác định loài sán lá gan nhỏ ở người bằng hình thái học và sinh học phân
3.1.3.1.Xác định loài sán trưởng thành ở người bằng hình thái học
Những bệnh nhân nhiễm sán với cường độ cao nhất được lựa chọn để thu hồi SLGN nhỏ trưởng thành. Những bệnh nhân này được yêu cầu phải ăn nhẹ vào bữa tối hôm trước khi điều trị tẩy đãi, nên ăn cơm với trứng luộc, không ăn các loại rau.
Khuyến khích các bệnh nhân đi đại tiện trước khi đi ngủ. Giải thích cho bệnh nhân tại sao phải điều trị, thu hồi mẫu sán. Không ăn sáng trong buổi sáng của ngày điều trị, có thể uống nước. Trước 8 giờ sáng hướng dẫn bệnh nhân đến trạm y tế để tiến hành tẩy đãi sán. Mỗi bệnh nhân uống praziquantel và đợi trong khoảng 60 phút.
Sau 60 phút mỗi bệnh nhân uống khoảng 30g MgSO4 hoà tan trong nước, tiếp tục uống thêm nước (tổng số nước uống của bệnh nhân trong buổi sáng khoảng 2-3 lít).
Đợi cho tới khi bệnh nhân bắt đầu đi ngoài (vẫn tiếp tục uống nước). Bỏ phần phân rắn cục lần đi ngoài đầu tiên. Thu toàn bộ phân đi trong 3-4 lần liên tiếp. Mỗi bệnh nhân đi ngoài vào một bô riêng có gắn nhãn ghi tên, tuổi. Nếu bệnh nhân không thể đi ngoài tiếp trong hơn 30 phút sau khi đã thu được số lượng phân 3-4 lần liên tục thì có thể cho bệnh nhân về nhà. Tiến hành thu sán trưởng thành bằng cách: loại bỏ phân rắn cục trong lần đi ngoài đầu tiên, hoà số phân của mỗi bệnh nhân trong 1-3 lít nước trong bô. Lọc phân qua rây có mắt lưới 1x1mm, thu phần phân trên rây, phần hỗn dịch qua rây hoặc cả trên và dưới rây. Đặt phần cặn trên rây chuyển ra khay men có đường kính lớn hơn 9 cm để tìm sán, tìm từng phần nhỏ một bằng mắt thường hoặc dùng kính lúp để tìm. Thu hồi sán để cố định trong 10% formalin ở nhiệt độ phòng để nhuộm và định loại sán bằng hình thái học và cố định trong cồn 70% để làm sinh học phân tử.
Nghiên cứu đã thu thập được 26 mẫu sán, đãi từ phân của những đối tượng nghiên cứu, trong đó 20 mẫu sán được dùng cho xác định loài bằng hình thái học và 6 mẫu sán được dùng trong xác định loài bằng sinh học phân tử. Kết quả quan sát hình thái hoc như sau: sán có mầu đỏ nhạt, đen hoặc tía; cơ thể sán thuôn dẹt và mảnh dài, phần trước hẹp, sau tù; giác miệng ở đầu thân, giác bụng nằm ở phần ba trước cơ thể; hầu được kế tiếp bằng thực quản; hai nhánh ruột kéo dài về mút sau cơ
Luận án Y tế cộng đồng
thể; hai tinh hoàn phân nhánh hình cành cây, nằm một trước một sau ở phần sau cơ thể; ống bài tiết thẳng; tuyến noãn hoàng nằm bên ngoài 2 nhánh ruột; buồng trứng nằm ngay phía trên tinh hoàn; tử cung phát triển, gấp khúc nhiều lần, nằm ở khoảng giữa buồng trứng và giác bụng, chứa đầy trứng. Kích thước cơ thể nằm trong khoảng 10 -25 mm x 3-4 mm. Đo kích thước và quan sát hình thái nội quan của 20 mẫu sán cho kết quả như sau:
Bảng 3.3. Kích thước và hình thái nội quan của sán lá gan nhỏC. Sinensis (n=20)
Bộ phận Dài (mm) Rộng (mm)
Cơ thể 11,32 ± 3,65 2,53 ± 0,39
Giác miệng 0,51 ± 0,95 0,46 ± 0,12
Giác bụng 0,51 ± 0,08
Hầu 0,25 ± 0,06 0,24 ± 0,05
Thực quản 0,26 ± 0,12
Tinh hoàn 1,53 ± 0,49 1,92 ± 0,33
Buồng trứng 0,32 ± 0,08 0,58 ± 0,19
Tử cung Từ buồng trứng đến giác bụng
Trứng 0,028 ± 0,002 0,013 ± 0,001
Bảng 3.3 cho kết quả trung bình cộng về kích thước và hình thái nội quan của 20 mẫu sán thu được từ đãi phân của đối tượng nghiên cứu can thiệp là người như sau: sán có mầu đỏ nhạt, nâu hoặc tía; cơ thể sán thuôn dẹt và mảnh dài, phần trước hẹp, sau tù; giác miệng ở đầu thân, giác bụng nằm ở phần ba trước cơ thể; hầu được kế tiếp bằng thực quản; hai nhánh ruột kéo dài về mút sau cơ thể; hai tinh hoàn phân nhánh hình cành cây, nằm một trước một sau ở phần sau cơ thể; ống bài tiết thẳng; tuyến noãn hoàng nằm bên ngoài 2 nhánh ruột; buồng trứng nằm ngay phía trên tinh hoàn; tử cung phát triển, gấp khúc nhiều lần, nằm ở khoảng giữa buồng trứng và giác bụng, chứa đầy trứng. Kích thước cơ thể nằm trong khoảng 10 -25 mm x 3-4 mm, căn cứ vào khoá phân loạicủa Viện Sốt rét – Ký sinh – Côn trùng Trung ương xác định về hình thái học SLGN trưởng thành thu được ở người dân tại thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định là Clonorchis
Luận án Y tế cộng đồng
sinensis(Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea;
Opisthorchiida; Opisthorchiata; Opisthorchioidea; Opisthorchiidae; Clonorchis).
Hình 3.1. C. sinensis trưởng thành thu thập từ bệnh nhân là đối tượng nghiên cứu được điều trị tại thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định.
Hình 3.1. là ảnh chụp SLGN trưởng thànhthu thập từ phân của bệnh nhân sau khi uống thuốc praziquantel điều trị SLGN trong chương trình can thiệp của nghiên cứu được mô tả như sau: có hình lá, thân dẹt, màu đỏ nhạt, dài 11 mm, chiều ngang 3 mm, có hai hấp khẩu (hấp khẩu miệng có đường kính 600 m thông với đường tiêu hóa; hấp khẩu bụng có đường kính 500 m). Ống tiêu hóa chạy dọc hai bên thân sán và là ống tắc, không nối thông với nhau. Sán là lưỡng giới gồm tinh hoàn, buồng trứng, tử cung. Tinh hoàn gồm có hai, chia nhiều nhánh, chiếm gần hết phía sau thân. Buồng trứng ở khoảng giữa thân, tử cung là một ống ngoằn ngoèo gấp khúc. Lỗ sinh dục ở gần hấp khẩu bụng. Căn cứ vào khoá phân loại của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng–Côn trùng Trung ương xác định là loài: Clonorchis sinensis.
3.1.3.2.Xác định loài sán ở người bằng sinh học phân tử
Các giải trình tự nucleotid và acid amin chuỗi gen COX1 của mẫu nghiên cứu được so sánh với các chuỗi mẫu cox1 của Trung Quốc và Triều Tiên.
Bảng 3.4. Danh mục mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành thu nhận ở người tại thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định sử dụng giám định phân tử
Loài (hình thái)
Ký hiệu mẫu
Nguồn gốc Trạng thái mẫu Từ vật chủ
Clonorchis spp CsNgND Nam Định Sán trưởng thành Người
Luận án Y tế cộng đồng
Bảng 3.4 cho biết trong số 26 mẫu SLGN trưởng thành thu thập được từ phân của bệnh nhân được điều trị praziquantel từ chương trình can thiệp đã được xác định bằng hình thái học là loài Clonorchis spp, được tiếp tục phân tích bằng phương pháp sinh học phân tử để xác định thành phần loài SLGN, kết quả cụ thể như sau:
Giải trình trình tự chuỗi gen cox1 của mẫu nghiên cứu so sánh với các chuỗi mẫu:
NUCLEOTID
* 20 * 40 * 60 * 80 * 100
*
Cs(CN) : TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATGTGTTAATATTGCCGGGGTTTGGTATGATTAGTCACATTTGTACCACTTTAACAGGTAAAGATTCGTTGTTTGGTTATGGGGGCTTGGT : 113 Cs(Kor) : ... : 113 CsNgND : ...T... : 113 Fg(VN) : ...T...T...T...GG.T...C..T...TG...G..TAA...T...T..A...TAT..TC.TA. : 113 Fh(Aus) : ...T..G..T..A..C...GG.T...T...GTG...TAA...T...T...TAT..TC.TA. : 113 120 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 Cs(CN) : GTTGGCTATGTTTGCTATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTTAGCTCGGTTACTATGATTA : 226 Cs(Kor) : ... : 226 CsNgND : ... : 226 Fg(VN) : T...GC...A...T...T..T...G...TG..G..TT...G.ACAT...T..T...G... : 226 Fh(Aus) : T..A...GC...A...T.A...T..T...G...TG..G..TT...G..CAT...T..T...G... : 226
* 240 * 260 * 280 * 300 * 320 330 Cs(CN) : TAGGTGTGCCTACGGGGATCAAGGTTTTTTCATGATTATATATGCTT---GCTGGAACTCGGGAGCGTCTATGAGATCCAATCATGTGGTGGATAATCGGGTTTGTGGTGCTT : 339 Cs(Kor) : ...---... : 339 CsNgND : ...---... : 339 Fg(VN) : .T...A.T...T...T...C..T..G...ATA...T.GGGG.G...T.G.TCT.TT...A.T..G...TG.TG.A..A...TG.T..T...T..TT.G : 339 Fh(Aus) : .T...A.T...A..T..T...C...C..G..GATA...T.GGGG.GG..T.G.TCT.TT...A....G...TG.TG...A..T..A...A.T..TT.A : 339 0 * 360 * 380 * 400 * 420 * 440 Cs(CN) : TTCACTATAGGCGGGGTTACTGGGATAGTTCTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTTCATGATACTTGGTTTGTTATTGCTCATTTTCATTATGTTCTTTCTTT : 446 Cs(Kor) : ... : 446 CsNgND : ...A... : 446 Fg(VN) : ..T...T..T...T..TA.G...C.TT.G...A.G...C...G...GG... : 446 Fh(Aus) : ..T...T..T...T..TA.G...C.TT.G...A.T...C...A...GG... : 446
AMINO ACID
* 20 * 40 * 60 * 80 Cs(CN) : FFGHPEVYVLILPGFGMISHICTTLTGNDSLFGYGGLVLAMFAIVCLGSVVWAHHMFTVGLDLGTAVFFSSVTMIIGVPTGIKVFS : 86 Cs(Kor): ... : 86 CsNgND : ... : 86 Fg(VN) : ...V...M...N...Y..I...A...M....VH...V..I... : 86 Fh(Aus): ...V...V...N...Y..I...A...M....VH...V..I... : 86 * 100 * 120 * 140
Cs(CN) : WLYML-AGTRERLWDPIMWWIIGFVVLFTIGGVTGIVLSASVIDALFHDTWFVIAHFHYVLS : 148 Cs(Kor): ...-... : 148 CsNgND : ...-... : 148 Fg(VN) : ..I..GG.SSV.I...VV...V...M....LL.T.L...V... : 148 Fh(Aus): ..I..GG.SSV.I...VV...I...M....LL.T.L...V... : 148
Luận án Y tế cộng đồng
Hình 3.2. So sánh trình tự 446 nucleotid và 148 acid amin trong đoạn gen cox1 của SLGN trưởng thành Clonorchis spp trên người tại Nam Định (CsNgND) với C.
sinensis Trung Quốc (CsCN), C. sinensis Triều Tiên (CsKor) và đồng thời so sánh với các loài khác như Fasciola gigantica ở người Việt Nam (FgVN) và Fasciola hepatica ở Australia (FhAus). Ghi chú: dấu (.): biểu thị trình tự giống nhau của Clonorchis spp mẫu nghiên cứu với C.sinensis mẫu quốc tế; sai khác về nucleotid hoặc acid amin được thể hiện bằng các chữ cái ký hiệu của chúng.
Bảng 3.5. So sánh nucleotid tại 5 điểm có sự sai khác trong chuỗi gen cox1 của Clonorchis spp nghiên cứu với C. sinensis chủng Trung Quốc và Hàn Quốc Ký hiệu Chủng gốc Các vị trí trong chuỗi gen cox1
trong giải trình tự Quốc gia Địa phương 9 22 69 439 441
Cs(CN) Trung Quốc Quảng Tây C T C C T
Cs(Kor) Triều Tiên Nam Hàn C T C C T
CsNgND Việt Nam Nam Định C T T C A
Cs VN
Hình 3.3. Vị trí của C. sinensis Việt Nam trong cây phả hệ (C. sinensis Việt Nam nằm cùng nhóm với C. sinensis Trung Quốc và Triều Tiên)
CsNgND
Cs(CN) Cs(Kor)
Fg(VN) Fh(Aus)
0.02
Luận án Y tế cộng đồng