Chương 7 Các phương pháp phân loại
7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu
Biểu bì lá là một dấu hiệu có ý nghĩa trong phân loại đã được nhiều người sử dụng trước hết cấu trúc của các kiểu tế bào biểu bì ví dụ ở Vulpa (hình 7.3) hay các kiểu lông trên bề mặt, ví dụ ở Combretum (hình 7.1). Các kiểu lông tùy theo điều kiện chúng ta có thể xem dưới kính hiển vi thường hay kính hiển vi quét (hình 7.2).
Bên cạnh nghiên cứu cấu tạo lông, người ta sử dụng lưỡi dao để bóc các lớp biểu bì để xem cấu tạo hệ thống lỗ khí hoặc người ta dùng parafin lo•ng tráng qua bề mặt lá rồi sau đó bóc ra để xem cấu tạo các tế bào quanh lỗ khí. Ba mươi lăm kiểu lỗ khí đã tìm thấy trong thực vật có mạch (hình 7.1) có ý nghĩa lớn trong phân loại. Những kiểu đó thường có ý nghĩa ở các bậc taxôn cao. Ví dụ như ở Acanthaceae đặc trưng kiểu diacytic, trong khi đó có liên quan chặt chẽ với Scrophulariaceae với kiểu monomocytic… Trong họ Poaceae hoa tiêu giảm mạnh và các dấu hiệu đặc trưng rất hạn chế. Do đó người ta quan tâm các dấu hiệu giải phẫu cơ quan dinh dưỡng và tế bào học hơn trong đó các tế bào biểu bì được quan tâm.
7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ
Cấu tạo giải phẫu gỗ được nghiên cứu trên các bản cắt ngang, tiếp tuyến, xuyên tâm và tiêu bản làm mủn. Nó có ý nghĩa lớn trong tiến hóa (hình 7.3 – 7.8). Dụng cụ nghiên cứu là kính hiển vi hai mắt với vật kính x8, x20, x40; thị kính x7, máy ảnh, trắc vi thị kính, trắc vi vật kính.
7.2.2.1 Làm tiêu bản lát cắt
Theo tính chất của gỗ cứng hay mềm để có cách xử lý khác nhau, nếu là gỗ mềm thì cắt trực tiếp ngay, không cần qua các bước xử lý cũng được. Nếu là gỗ cứng thì xử lý bằng glyxerin và cồn hoặc đun trong nước sôi và để vài tiếng đồng hồ mới tiến hành cắt. Mục đích cho tống hết các bọt khí làm cho gỗ mềm ra và tiêu bản nguyên vẹn.
Chuẩn bị mẫu:
Hình 7.1.
Các dạng tế bào quanh lỗ khí (theo Dilcher, 1974)
A. anomocytic, B. cycocytic; C. amphicyclocytic; D. actinocytic, E. anisocytic, F. amphianisocytic, G. adiacytic, H. amphidiacytic, I.paracytic, J. amphiparacytic, K. brachyparacytic, L. amphibrachyparacytic, M. hemiparacytic, N. paratetracytic, O. amphitetracytic, P. brachyparacytic, Q. amphibrachyparatetracytic, R. staurocytic, S. anomotetracytic, T. parahexacytic-monopolar, U. parahexacytic-dipolar,
V. brachyparahexacytic-monopolar, W. brachyparahexacytic-dipolar, X. polocytic, Y. copolocytic, Z. axillocytic, AA. coaxillocytic, BB. desmocytic, CC. pericytic, DD.
copericytic, EE. amphipericytic
Hình 7.2.
Các dạng lông tuyến của chi Combretum: 6 tuyến có cuống và các tuyến khác dạng khiên (theo Dilcher, 1974)
* Khử nước ở nguyên liệu: Vật mẫu lấy ra khỏi dung dịch làm mềm phải được rửa thật kỹ bằng nước thường rồi ngâm lần lượt vào cồn 70o, cồn 96o, cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần
thứ hai và lần thứ ba. Thời gian ngâm mẫu khoảng từ 15 - 30 phút hoặc hơn tùy theo độ dày của vật mẫu.
* Chuyển vào dung môi trung gian: sau khi lấy mẫu ra khỏi cồn tuyệt đối lần thứ ba, chuyển mẫu vào metylbenzoat lần thứ nhất, rồi lần thứ hai, mỗi giai đoạn để 1 - 2 giờ sau đó đưa vào xylen lần thứ nhất và lần thứ hai, mỗi giai đoạn không quá 30 phút.
* Chuyển vào parafin: từ trong môi trường xylen ta chuyển tiếp như sau:
Xylen - parafin (tỷ lệ 3: 1), để ở nhiệt đồ bình thường trong 1 - 2 giờ.
Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 1), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ.
Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 3), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ, sau đó cho vào parafin nóng chảy trong tủ sấy ở nhiệt độ tủ cao không quá 62oC. Thời gian để phụ thuộc vào bề dày của mẫu và bản chất của mô, có thể để từ 10 - 12 giờ đến vài ngày. Nhiệt độ tủ sấy phải giữ đều.
Hình 7.3.
Các dạng tế bào biểu bì của Vulpia alopecuros: A. Mặt bụng; B. Mặt lưng và
V. tenuis: C. Mặt bụng; D. Mặt lưng (theo Cotton và Stace, 1977). Tế bào silic có màu đen
* Đúc khối parafin để dựng vật mẫu:
Khi parafin đã ngấm hoàn toàn vào vật mẫu thì đem đúc thành khối, sau đó để nguội.
Chú ý: Nên đặt vật mẫu vào giữa khối parafin. Nếu cần, điều chỉnh vật mẫu sau khi parafin đã đông đặc thì phải dùng một kim sắt hơ nóng để cho parafin chảy nóng trở lại.
• Chuẩn bị khối parafin đựng vật mẫu: trong khối parafin nói trên thường chứa nhiều vật mẫu do đó phải chia mỗi mẫu nằm trong một khối parafin nhỏ riêng. Sửa các khối parafin mang vật mẫu thành hình thang cụt có đáy vuông. Các cạnh đối diện của mặt cắt phải song song với nhau.
Gắn khối parafin này lên một miếng gỗ nhỏ bằng cách hơ nóng lưỡi dao mổ trên đèn cồn rồi làm chảy parafin ở hai mặt cắt gắn với nhau. Sửa lại khối parafin một lần nữa để cho mặt cắt phải thật phẳng, các cạnh thật vuông góc với nhau và để cho các lát cắt vào ngay với mặt cắt.
- Tiến hành cắt: Có thể cắt bằng tay hoặc bằng máy cắt. Sau khi gỗ đã được làm mềm tiến hành cắt theo 3 mặt phẳng: ngang, tiếp tuyến và xuyên tâm.
Với độ dày vừa phải (khoảng 15 - 18 *m) để vừa mỏng vừa giữ được các yếu tố nguyên vẹn. Sau đó sửa thành các mảnh một cách cân đối (vuông hay chữ nhật).
- Loại parafin ở lát cắt: để có thể nhuộm và quan sát được vi phẫu, cần loại hết parafin trên lát cắt.
Phương pháp loại parafin như sau: chuyển các mẫu qua lần lượt các ống Boren đựng các dung dịch dưới đây.
Xylen (lần thứ nhất) Thời gian 10 phút Xylen (lần thứ hai) Thời gian 5 phút
Xylen - cồn tuyệt đối (3:1) Thời gian 5 phút Xylen - cồn tuyệt đối (1:1) Thời gian 5 phút Xylen - cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian 5 phút Cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian 5 phút
Cồn 96o Thời gian 5 phút
Cồn 70o Thời gian 5 phút
Cồn 50o Thời gian 5 phút
Cồn 30o Thời gian 5 phút
Nước cất: Thời gian 5 phút
Sau đó chuyển tiêu bản vào các chậu đựng thuốc nhuộm tùy theo yêu cầu nghiên cứu.
* Nhuộm màu:
Thuốc nhuộm safranin 1 - 9% trong cồn tuyệt đối, khi dùng ta phải pha lo•ng gấp đôi.
Cách nhuộm: Lấy các lát cắt ra thấm khô và tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm safranin từ 5 phút đến 2 giờ. Sau đó cố định trong HCl và rửa bằng nước cất cho sạch.
Chuyển sang giai đoạn loại nước.
Loại nước: Để loại hết nước các bản cắt được ngâm trong các dung dịch cồn từ nồng độ thấp đến cao. Vì cồn tan trong nước và sẽ rút dần dần nước ra. Sau đó chuyển sang dung dịch cồn + xylen. D•y các dung dịch xylen nồng độ cao dần để loại hết cồn ra
(do keo canada chỉ tan trong xylen). Cuối cùng chuyển sang dung dịch xylen + cacbon có tác dụng khử trùng. Vật mẫu ngâm trong các dung dịch với khoảng thời gian từ 15 đến 30 phút hoặc hơn.
Hình 7.4.
Các giai đoạn tiến hóa của phiến rây từ kép đến đơn (Takhtajan 1964)
Hình 7.5.
Lát cắt xuyên tâm gỗ của Tetracentro sinensis (Takhtajan 1964)
* Dán tiêu bản:
Chuẩn bị lamen và lam kính sạch. Đặt các lát cắt đã loại hết nước và ngâm trong dung dịch xylen + cacbon lên lam kính, sửa đúng hướng, nhỏ vài giọt keo canada và đậy từ từ lamen tránh cho bọt khí xuất hiện.
7.2.2.2 Làm tiêu bản ngâm mủn
Dựa trên nguyên tắc một số hóa chất có tác dụng phá hủy màng gắn giữa các tế bào, làm
cho các tế bào tách rời nhau ra. Phương pháp này thường dùng để nghiên cứu từng tế bào nguyên vẹn mà không làm hư hại chúng.
Phương pháp tiến hành như sau:
* Làm mủn: Cũng lấy ở mẫu gỗ ban đầu chẻ vài que nhỏ bỏ vào ống nghiệm, cho một vài tinh thể KCIO3, thêm HNO3 và sau đó thêm một ít nước cho ngập gỗ và đun bằng đèn cồn khoảng 15 - 20 phút. Khi thấy các que gỗ đã trắng ra, dùng đũa thủy tinh đánh cho gỗ tơi ra, để lắng và dùng nước cất rửa axit, sau đó ngâm trong cồn khoảng 15 phút. Tiến hành quá trình nhuộm.
* Nhuộm mẫu: Dung dịch nhuộm là safranin 1 - 9% trong cồn. Thấm khô mẩu gỗ mủn bằng giấy thấm, cho vài giọt thuốc nhuộm safranin (cho ướt hết mẫu) để khoảng 5 phút, cố định bằng HCl, rửa nước và sau đó tiến hành loại nước.
• Loại nước: Ngâm trong dung dịch cồn 90o khoảng 15 phút, chuyển sang cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần thứ hai để rút nước ra, sau đó là quá trình rút cồn khỏi tế bào bằng xylen (vì keo canada chỉ tan trong xylen chứ không tan trong cồn). Quá trình này tiến hành bằng cách chuyển mẫu sang dung dịch cồn + xylen lần thứ nhất, lần thứ hai và cuối cùng là cacbon xylen tương tự như trên tiêu bản cắt lát.
Hình 7.6.
Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ từ kiểu hình thang của kiểu trung gian và từ kiểu đối nhau tới kiểu cách nhau (Takhtajan 1964)
Hình 7.7.
Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ hình thang từ kiểu thủng lỗ nguyên thủy có nhiều vách ngang tới kiểu thủng lỗ
chuyên hóa chỉ có một số vách ngang (Takhtajan 1964)
• Dán tiêu bản: Sau khi mẫu đã được loại nước và thấm xylen lấy một ít mủn, dùng kim mũi mác dàn đều trên lam kính đã sạch và khô, nhỏ vài giọt keo canada và từ từ đậy lamen.
7.2.2.3 Quan sát
* Quan sát bằng mắt thường cấu tạo chung của gỗ.
* Quan sát trên kính hiển vi và mô tả.
* Đo đạc trên kính hiển vi dựa trên trắc vi vật kính và trắc vi thị kính các yếu tố cần mô tả.
* Chụp ảnh và mô tả.
7.2.2.4 Đánh giá và phân loại
Căn cứ trên bản mô tả và các sơ đồ tiến hóa, chúng ta phân tích, đánh giá các mức độ tiến hóa khác nhau, có thể lập thành khóa xác định.