Chương 7 Các phương pháp phân loại
7.5 Phương pháp phân loại izoenzym
Enzym hay izoenzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học ở trong cơ thể sống hoặc ở ngoài tế bào khi có đủ điều kiện cho các phản ứng đó xảy ra.
Izoenzym là thuật ngữ để chỉ các biến dạng của enzym, các dạng tồn tại trong quần thể tự nhiên, là kết quả của các phản ứng gây ra sự thay đổi các axit amin trong cấu trúc bậc một của chuỗi polypeptide. Cấu trúc này lại do trật tự của các nucleotid trong gen quy định. Chính vì vậy khi sử dụng phương pháp điện di trên gen agarose, tinh bột thủy phân, polyacrylamid cùng với việc phối hợp nhuộm hóa tế bào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của phân tử enzym.
Bởi vậy việc sử dụng các dẫn liệu về đa hình các izoenzym không những hiểu biết gen của cá thể mà biết mức độ dị hợp của quần thể. Mặt khác mỗi biến dạng phân tử enzym là một
“marker” của gen. Vì vậy nó được sử dụng cho loài. Trong nội bộ loài, việc sử dụng các dẫn liệu đa hình thông qua tần số alen của các locut cũng có thể chỉ ra tính chất đặc trưng cho các vùng phân bố của loài. Trên cơ sở như vậy người ta dùng izoenzym để phân biệt các cá thể thuộc các đơn vị phân loại giữa các thứ hoặc giữa các loài, giữa các loài đồng hình, loài chị em...
Phương pháp phân tích tính đa hình của izozym là một trong những phương pháp phân loại ở mức độ phân tử do nó đã tiếp cận với những sản phẩm trực tiếp của quá trình dịch m• di truyền.
Nhờ tớnh rừ ràng của kết quả và sự đa hỡnh của cỏc hệ enzym được sử dụng, kết quả phõn tích mang độ chính xác cao và tin cậy.
Nó được sử dụng rộng r•i trong việc nghiên cứu mối quan hệ trong và ngoài loài, góp phần xây dựng mối quan hệ xác thực trong hệ thống học của sinh giới, là công cụ đắc lực hỗ trợ cho các nhà phân loại trong trường hợp các khóa phân loại hình thái không đủ để giải quyết vấn đề. Tất nhiờn cũng cần núi rừ phương phỏp này dự nú cú phản ảnh bản chất di truyền của loài hay bất kỳ một taxôn nào khác nhưng nó không thể thay thế cho phương pháp phân loại truyền thống. Nó sẽ giúp cho việc hoàn chỉnh và làm chính xác cách phân loại truyền thống trên cơ sở dựa vào các dấu hiệu hình thái bên ngoài. Mỗi sự thay đổi của gen đều được thể hiện qua tính đa dạng của các izoenzym nhưng chưa chắc các biến đổi đó đã được di truyền lại cho các thế hệ mai sau. Vì vậy phải tìm, phải sàng lọc và lựa chọn những biến đổi nào đặc trưng cho loài. Đấy mới là điều quan trọng. Chính vì vậy phương pháp này chỉ ra cho ta thấy mức độ đa dạng của các gen bên trong và qua đó giúp cho ta biết mối quan hệ huyết thống giữa các taxôn.
7.5.2 Phương pháp phân tích izozym bằng kỹ thuật điện di
Phương pháp này được sử dụng rộng r•i trong nghiên cứu hệ thống học bởi 5 lý do sau:
1. Mẫu cần phân tích rất nhỏ
2. Một lần phân tích được nhiều mẫu
3. Các chất dùng cho chạy điện di không quá đắt tiền 4. Dụng cụ chạy điện di khá phổ biến
5. Kết quả thu được phản ảnh gián tiếp sự có mặt của các alen trong cơ thể đối tượng nghiên cứu.
Tuy nhiờn cũng cần chỉ rừ kết quả trờn trước hết cú ý nghĩa lớn để đỏnh giỏ mối quan hệ họ hàng giữa các taxôn, còn việc sử dụng phương pháp này cũng như các phương pháp phân tích ADN dùng trong phân loại không phải đơn giản. Việc nhận dạng và suy luận kết quả của phép phân tích điện di cần phải tuân theo những nguyên tắc đặc thù và đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải am hiểu các phạm trù trong phân loại học, am hiểu đối tượng mà mình nghiên cứu và phải có quá trình nghiên cứu lâu dài trên cơ sở lấy phương pháp phân loại bằng hình thái làm cơ sở. Về giá trị phân loại của hai phương pháp này có tính hiện thực chỉ khi nào nghiên cứu một cách đầy đủ và trọn vẹn một taxôn nào đấy. Trên cơ sở đó mới tìm ra các marker đặc trưng có ý nghĩa trong phân loại. Nếu chỉ phân tích từng phần của một taxôn và không phân tích có tính hệ thống thì những số liệu đó chỉ mới nói lên tính đa dạng của taxôn đó hay chỉ dừng lại xem xét mối quan hệ họ hàng ở mức tương đối mà thôi và nếu tách phương pháp này khỏi phương pháp phân loại hình thái như một số nhà sinh học phân tử đã làm lại là một sai lầm không thể chấp nhận.
7.5.2.1 Kỹ thuật điện di
Điện di là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng r•i để tách một hỗn hợp các hợp chất có khả năng ion hóa. Điện di trên gel kết hợp dựa vào điện tích và quá trình tách dựa vào kích thước phân tử của các đối tượng tham gia điện di. Một quá trình điện di cơ bản gồm các bước sau:
* Chuẩn bị mẫu cho phép điện di: Do sự xuất hiện và hàm lượng của các izoenzym là khác nhau ở các bộ phận trong cơ thể, các trạng thái phát triển, điều kiện môi trường. Cần phải nghiên cứu để tìm ra vật liệu phù hợp cho việc tách mẫu ban đầu. Mẫu phải được bảo quản trong điều kiện tránh sự phân huỷ của izoenzym.
* Đổ gel: Tùy theo độ giống nhau của các izoenzym mà chọn nồng độ gel đảm bảo có độ phân giải cao nhất đối với hệ izoenzym cần nghiên cứu.
* Chuẩn bị dung dịch đệm: Dựa vào tài liệu tham khảo cũng như kinh nghiệm thực tế để chuẩn bị các dung dịch đệm có nồng độ và giá trị pH phù hợp và chính xác để đảm bảo kết quả phân tích sẽ lặp lại.
* Lựa chọn các thông số về dòng điện, thế năng của nguồn điện di và thời gian chạy mẫu.
* Cắt lát gel: Trong trường hợp chạy gel tinh bột, người ta cắt lát các lớp gel từ tấm gel dày ban đầu. Các lớp này có thể dùng để nhuộm với các chất nhuộm màu đặc hiệu khác nhau.
* Nhuộm gel hay hiện gel: Sau phép chạy điện di, các izozym chưa thể nhìn thấy mà phải làm cho chúng phát màu nhờ những phản ứng được xúc tác bởi các enzym đó. Kết quả
của bước này phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của hỗn hợp phản ứng và điều kiện ủ cho phản ứng xảy ra như pH, nhiệt độ, cơ chất, tác nhân nhuộm,…
7.5.2.2 Đọc kết quả nghiên cứu
Để phục vụ cho nghiên cứu phân loại, việc xử lý thông tin sau khi chạy điện di cần phải dựa trên những kiến thức về di truyền học tiến hóa. Đây là phần rất quan trọng vì kết quả điện di chỉ là một hình ảnh chết nếu người nghiên cứu không hiểu được tương quan hệ nội hàm giữa các sản phẩm izoenzym và cấu trúc các alen trong hệ gen m• hóa cho các sản phẩm izoenzym. Đọc kết quả điện di có thể hiểu là quá trình xây dựng bảng tương quan giữa vị trí của các băng điện di và số alen quy định các izoenzym.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra cấu trúc khác nhau của phân tử enzym có thể biểu hiện trên điện di đồ là khác nhau. Xét một số trường hợp cụ thể sau:
a. Trường hợp phân tử enzym có cấu trúc monomer do một alen trên một locut gen gồm hai alen điều khiển, thì những cá thể đồng hợp tử trội mang kiểu gen AA và đồng hợp tử lặn mang kiểu gen aa sẽ có một băng (pattern), còn cá thể dị hợp tử mang kiểu gen Aa sẽ có hai băng (hình 7.15a).
b. Trong trường hợp phân tử enzym là monomer, locut gen chứa ba alen đồng trội thì những cá thể đồng hợp tử mang kiểu gen AA, aa, a’a’ có một băng, còn cá thể dị hợp tử Aa, Aa’ và aa’ có biểu hiện bởi hai băng (hình 7.15b).
c. Trong trường hợp phân tử enzym là dimer thì mỗi locut sẽ liên quan tới hai sợi polypeptide, giả sử có hai alen A và a, mỗi alen m• cho một chuỗi polypeptide, sự phân ly của kết quả điện di được minh họa trong hình 7.15c.
Trong hình 7.15 ta thấy cá thể dị hợp tử (Aa) mang 3 băng, trong đó có một băng là biểu hiện của mức di truyền trung gian, là kết quả của sự kết hợp giữa hai chuỗi polypeptide do hai alen khác nhau của một locut gen kiểm soát.
d. Trường hợp phân tử enzym có cấu trúc tetramer, nghĩa là phân tử này do 4 chuỗi polypeptide tạo thành. Trong trường hợp này các cá thể đồng hợp tử biểu hiện một băng, còn cá thể dị hợp tử biểu hiện 5 băng trên điện di đồ. Ta đặt giả thiết alen A tổng hợp chuỗi polypeptide a và gen a tổng hợp chuỗi polypeptide b, cá thể lai biểu hiện 5 băng tương ứng (hình 7.15d).
Trong một số trường hợp phân tử enzym do một locut gen có hai alen kiểm soát trong đó có một alen có hoạt tính và biểu hiện màu còn alen thứ hai không biểu hiện màu gọi là alen không (null allele) thì trên điện di đồ sẽ có 3 dạng kiểu hình, một dạng biểu hiện một băng nhuộm màu rừ nột, một dạng khụng biểu hiện là cỏc cỏ thể đồng hợp tử, cũn dạng cú băng nhạt màu và mảnh là các cá thể dị hợp tử (hình 7.16).
7.5.2.3 Tính tần số alen
Sau khi xác định sự biểu hiện của các alen ta sẽ phân tích tần số của chúng trong đối tượng nghiên cứu theo các công thức sau:
Khi số alen là 2 (A, a), tần số xuất hiện
Với AA, Aa, aa là số cá thể mang kiểu gen tương ứng, N là số cá thể mang phân tích * 25 và đảm bảo thỏa m•n hệ số *2.
Khi số alen là 3 (A, a, a1), tần số xuất hiện cũng được tính tương tự
Tính hệ số tương đồng di truyền I hay khoảng cách di truyền D:
Theo tác giả Nei hệ số tương đồng di truyền được tính như sau:
trong đó:
XA ,YB là các tần số của alen tương ứng.
Ví dụ: Quần thể muỗi QTx có:
Tần số A = 0,46 Tần số alen a= 0,54 Quần thể muỗi QTx có:
Tần số alen A= 0,88 Tần số alen = 0,12
Từ đó ta tính được :
Mức độ giống nhau về mặt di truyền là: 0,745.
Từ hệ số tương đồng trên, khoảng cách di truyền D được tính theo công thức: .
7.5.2.4 Lập cây chủng loại phát sinh dựa trên hệ số tương đồng I
Là phương pháp tính toán mối quan hệ huyết thống của các nhóm tham gia quá trình phân loại. Từ giá trị I thu được của các nhóm khác nhau người ta lập bảng và xây dựng cây chủng loại phát sinh.
Nếu I >
0,5 thì các nhóm nghiên
cứu thuộc về một loài, sự khác biệt của hệ Izozym chỉ mang ý nghĩa biến dị trong loài.
Nếu I<0,5 thì có thể sơ bộ kết luận đó là hai loài riêng biệt.
Ví dụ: Có 5 loài ký hiệu là L1, L2, L3, L4, L5 Có hệ số I giữa 2 loài.
Quy thành nhóm như sau:
L2 L3 L4 L5
L1 0,48 0,36 0,35 0,27
L2 0,83 0,12 0,03
L3 0,05 0,01
AA Aa aa
Tr−ờng hợp a
AA Aa’ a’a’ Aa a’a aa Tr−ờng hợp b
AA Aa aa
Tr−ờng hợp c
AA aa Aa
Tr−ờng hợp d
Hình 7.15. Sơ đồ kết quả điện di
AA Aa aa
Hình 7.16.
Sơ đồ kết quả điện di alen không
L4 0,53
Ở đây ta thấy giữa L2 L3 có số lớn nhất (0,83) - có quan hệ gần nhất được quy thành 1 nhóm:
L2/3 L4 L5
L1 0,42 0,35 0,27
L2 0,085 0,02
L4 0,53
Để tìm tiếp mối quan hệ giữa L4/5 và L1/2/3 ta cần nhóm tiếp như sau:
L4/5
L1 0,31
L2/3 0,05 → 0,18
Cây chủng loại phát sinh của 5 loài trên được lập như sau: