Chương 7 Các phương pháp phân loại
7.6 Phương pháp phân loại bằng ADN
Từ thập kỷ tám mươi của thế kỷ XIX việc phát triển các chỉ thị ADN hay còn gọi là dấu phân tử đã được tiến hành. Đó là các chỉ thị về đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP, Botstein và cs, 1980); Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (RAPD, Wiliam và cs.1990);
Tiểu vệ tinh (microsatellite, Litt và Luty, 1989) hay còn gọi là sự lặp lại các chuỗi đơn giản (SSR, Jacob và cs, 1991) và đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (AFLP, Zabeau và Vos, 1993).
7.6.1 Kỹ thuật phản ứng trùng hợp - PCR
Nguyên lý: dùng một đoạn gen hay mẫu rất nhỏ ADN rồi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân lên gấp bội dùng trong nghiên cứu.
Các nguyên liệu cần thiết:
* ADN đích hay ADN khuôn
* ADN polymerase bền nhiệt (Taq, Vent, Pfu…)
* Một hay nhiều đoạn mồi (primer) nghèo nucleotid
* Bốn loại Didesoxyribonucleotidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
* Đệm phản ứng chứa MgCl2.
Các bước tiến hành: Mỗi một chu kỳ tiến hành theo 3 bước sau:
* Biến tính: dùng nhiệt độ 90 - 95oC trong 30 giây đến vài phút để tách ADN khuôn thành 2 sợi đơn.
* Lai hay bắt cặp mồi: nhiệt độ hạ xuống 50 - 70oC trong 30 giây đến vài phút để cho các mồi nghèo nucleotid bắt cặp với các sợi đơn tại các trình tự bổ sung.
* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC trong 30 giây đến vài phút để cho ADN polymerase bền nhiệt tổng hợp sợi mới theo nguyên tắc bổ sung.
Chu kỳ thường được lặp lại 25 - 30 lần và lúc đó số lượng sẽ tăng lên 106 lần số lượng ban đầu.
Từ phương pháp này người ta đã bổ sung, cải tiến tạo ra nhiều phương pháp khác nhau gọi là các dấu hiệu chỉ thị (marker).
7.6.2 Phân loại dựa trên kỹ thuật cắt giới hạn - RFLP
Đây là kỹ thuật sử dụng các enzym cắt hạn chế, cắt ADN thành các đoạn nhỏ có độ dài khác nhau. Khi hai hoặc nhiều cá thể được so sánh với một đoạn dò RFLP thì có thể có sự khác nhau về độ dài các đoạn cắt. Sự khác nhau này gọi là sự đa hình. Các đoạn này có thể di truyền và được sử dụng như các dấu phân tử. Dựa trên số đoạn ADN tương đồng của các băng điện di để xác định sự giống nhau hay mối quan hệ họ hàng gần gũi.
Phương pháp tiến hành:
* Tách ADN
* Cắt ADN thành những đoạn nhỏ nhờ các enzym giới hạn
* Phân tích các đoạn ADN bằng điện di trên gel
* Chuyển các đoạn ADN sang một màng lọc
* Hiển thị các đoạn ADN bằng công cụ thăm dò hay đánh dấu phóng xạ
* Phân tích các kết quả.
Thuận lợi của phương pháp này: kết quả có khả năng thực hiện giữ ở các phòng thí nghiệm; các chỉ thị RFLP thường chỉ ra sự kế thừa tương đồng của các dị hợp tử có thể nhận ra từ đồng hợp tử; có khả năng phân biệt ở mức độ loài, quần thể hay cá thể và phương pháp đơn giản.
Tuy nhiên áp dụng phương pháp này có một số hạn chế: tốn nhiều thời gian, chi phí cao;
hầu hết công việc phân tích cần đến đánh dấu phóng xạ nên bị phụ thuộc nơi tiến hành công việc.
7.6.3 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình - RAPD
Phương pháp này dựa trên phản ứng PCR, sử dụng một hay hai đoạn mồi tự ý ngắn 6-10 bazơ để nhân một đoạn ADN gi•n xoắn nào đó và có thể phân tách và hiển thị bằng điện di trên gel.
Quá trình được thực hiện trên máy PCR, PTC-100 (MJ Research Inc. Mỹ). Các phản ứng được thực hiện trong thể tích 25 *l chứa 10 - 25 ng ADN genom, 2,5 *l đệm PCR có nồng độ gấp 10 lần (đệm PCR x 10), 0,2 mM mồi, 200 mM dNTP, 1,5mM MgCl2 và 0,5 đơn vị Taq ADN polymerase.
Phản ứng được thực hiện theo 3 bước:
* Biến tính ADN ở 94oC trong 1 - 3 phút
* Lai: hạ nhiệt xuống 35oC trong 1 phút
* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC trong 2 - 5 phút.
Các sản phẩm RAPD được phân tích bằng điện di trên gen agaroza 1%. Kết quả cho các băn khác nhau. Từ đó tiến hành đánh giá mối quan hệ của hai taxôn nào đó.
Kỹ thuật này có ưu điểm là phát hiện nhanh chóng các dấu hiệu; kỹ thuật đơn giản, không liên quan đến phương pháp lai và chụp ảnh phóng xạ; chỉ cần một lượng cực nhỏ ADN và chi phí thấp.
7.6.4 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân đoạn AFLP
Kỹ thuật AFLP là kết hợp giữa kỹ thuật RAPD và nhân đoạn PCR được tiến hành theo các bước sau:
* Cắt ADN genom bằng enzim cắt giới hạn EcoR1 và Msel: Để làm việc này, lấy 0,3 mg ADN ủ 2 giờ ở 37oC với 3 đơn vị EcoR1 and 3 đơn vị Msel, 6 ml dung dịch điện có nồng độ gấp 5 lần (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgAc, 250 mM KAc).
* Gắn các đoạn cắt với đoạn tiếp hợp: Sau khi cắt, lấy 10 ml hỗn hợp dùng để gắn (1ml đoạn tiếp hợp EcoR1 (5 pmol/ml) và 1 ml đoạn tiếp hợp Msel (50 pmol/ml), 1ml 10 mM ATP, 1ml T4 ADN ligase và 4 ml nước cất vô trùng) cho vào 20 ml ADN đã được cắt. Phản ứng gắn được thực hiện ở 20oC trong 3 giờ. Sau khi gắn các tiếp hợp, ADN được làm lo•ng 10 lần và giữ ở -20oC.
* Nhân đoạn bước đầu: Trước khi nhân chọn lọc các đoạn ADN đã gắn các tiếp hợp được nhân bước đầu với các mồi tiền nhân EcoR1 (5’-GACTGCGTACCAATTC-3’) và Msel (5’GATGAGTCCTGAGTAA3’). Dung dịch phản ứng nhân bước đầu gồm 5ml ADN đã gắn tiếp hợp và pha lo•ng 10 lần và 25 ml hỗn hợp tiền nhân (0,5 ml mồi tiền nhân EcoR1 (100 ng/ml), 0,5 ml mồi tiền nhân Msel (100 ng/ml), 1,3ml 5mM dNTP, 3ml 10 x đệm PCR, 1,2 ml 50 mM MgCl2, 0,2 ml 5 đơn vị/ml Taq ADN polymerase, và 18,3 ml nước cất vô trùng).
Phản ứng nhân được thực hiện bằng 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 30 giây ở 94oC, 1 phút ở 56oC, 1 phút ở 72oC.
* Nhân chọn lọc: Việc nhân chọn lọc các đoạn ADN đã được gắn tiếp hợp và nhân bước đầu được tiến hành với việc sử dụng các mồi có 2 hoặc 3 nucleotide chọn lọc.
Các mồi chọn lọc EcoR1 có chuỗi nucleotide chung là 5GACTGCGTACCAATT3’ còn các mồi chọn lọc Msel có chuỗi nucleotide chung là 5’GATGAGTCCGAGTAA-3’. Các mồi chọn lọc khác nhau ở chỗ ngoài chuỗi nucleotide chung chúng có từ 1 đến 3 nucleotide chọn lọc. Chẳng hạn EcoR1-C, EcoR1-CT, EcoR1-CAT hay Msel-A, Msel-AG, Msel-GC.
Nhân chọn lọc được thực hiện trong 12ml dung dịch gồm 6 ml hỗn hợp phản ứng (1,25 ml 10 x đệm PCR, 0,6 ml 50 mM MgCl2, 0,6 ml 5 mM dNTP, 0,5 ml mỗi loại mồi chọn lọc, 0,1 ml 5 đơn vị Taq ADN polymerase và 3 ml nước cất vô trùng). Phản ứng nhân chọn lọc được thực hiện bằng 36 chu kỳ như sau: 1 chu kỳ gồm gi•n xoắn ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 65oC trong 1 phút và kéo dài mồi ở 72oC trong 2 phút; tiếp theo là 12 chu kỳ với nhiệt độ gắn mồi giảm 0,7oC sau mỗi chu kỳ; cuối cùng là 23 chu kỳ với nhiệt độ gắn mồi là 56oC.
Các sản phẩm nhân chọn lọc được phân lập bằng điện di trên gel polyacrylamide biến tính 5%. Điện di được tiến hành với dòng điện công suất ổn định 75W trong 2 giờ. Sau điện di gel được nhuộm bằng nitrate bạc.
Ưu điểm của kỹ thuật này là: Độ nhạy cao; tái thực hiện; ứng dụng rộng r•i; phân biệt được dị hợp tử. Tuy nhiên có một số hạn chế: chi phí cao; yêu cầu kỹ thuật nghiêm ngặt và phải sử dụng chất phóng xạ.
7.6.5 Phân loại dựa trên kỹ thuật tiểu vệ tinh là các đoạn ADN ngắn có một số lượng các chuỗi nucleotid lặp lại - SSR
Kỹ thuật SSR được thực hiện bằng phản ứng PCR của ADN genom với các mồi SSR.
Các chuỗi lặp lại này thường có một đến sáu nucleotid. SSR được khám phá và sử dụng đầu tiên ở người, hiện nay được dùng để lập bản đồ phân tử người, động vật và một số thực vật. SSR cũng được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật và thực vật, cũng như mối quan hệ giữa các quần thể và cá thể trong loài. Các alen SSR thường hơn kém nhau một số nucleotit xác định nên có thể điện di đồng thời sản phẩm nhân bản bốn locut trong cùng một đường chạy, nhờ đó tiết kiệm thời gian và chi phí.
Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, có tính lặp lại cao… Đây là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu mối quan hệ huyết thống.