Chương 7 Các phương pháp phân loại
7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào
Đối tượng nghiên cứu của hệ thống học tế bào thực vật là bộ thể nhiễm sắc của toàn bộ các taxôn thực vật bậc thấp cũng như bậc cao. Để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc phục vụ cho hệ thống học thực vật người ta thường tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân bào nguyên nhiễm cụ thể người ta thường sử dụng mầm non của lá, đỉnh sinh trưởng của thân, đỉnh rễ non của cây hoặc đỉnh rễ chính của hạt vừa nẩy mầm vì đó là vùng đang ở giai đoạn phân chia mạnh nhất và vùng phân chia ở ngay ở dưới lớp bao của các cơ quan đó. Bên cạnh đó người ta còn tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân bào giảm nhiễm cụ thể người ra dùng bông non đối với họ Lúa (Poaceae) ngay sau hay khi mới nhú bông hoặc nụ hoa đối với các loài khác lúc chưa có màu đặc trưng hoặc từ hạt phấn cho nẩy mầm trong ống nghiệm.
Phương pháp thông thường tiện lợi và dễ chủ động nhất là gieo hạt trong đĩa petri ở nhiệt độ 23 – 25oC cho hạt nẩy mầm. Thời gian nẩy mầm tuỳ theo từng loại 1 - 2 ngày đến vài tuần lễ. Độ dài của rễ từ 0,8 - 2 cm là dùng được. Người ta tiến hành dùng panh hay kim mũi mác ngắt một đoạn cách đỉnh rễ khoảng 2 mm và nhúng vào dung dịch cố định. Bên cạnh gieo hạt trong đĩa petri người ta còn có thể tiến hành trồng cây trong chậu với đất ẩm và tơi xốp. Đối với các loài cây gỗ có hạt to và có vỏ cứng tốt nhất lấy trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng của thân hay lá non hoặc có thể trồng thành cây con và sau đó lấy trực tiếp từ đỉnh rễ non. Trước khi lấy 1 - 2 giờ hoặc từ đêm hôm trước cần tưới nước cho đất đủ ẩm để kích thích rễ phát triển.
Thời gian lấy rễ tốt nhất trong khoảng 8 - 10 giờ sáng tùy mùa, đối với các loài cây sinh sản
bằng căn hành, thân củ hay bằng hom v.v. thì phải đặt hom, củ hay căn hành trong cát ướt hoặc trong lọ đựng nước có hỗn hợp chất dinh dưỡng nhân tạo.
Hình 7.12.
Hình thái rãnh trên bề mặt hạt phấn (Webster)
1., 2. Hạt phấn 3 rãnh, 3. Hạt phấn 4 rãnh; 4. Hạt phấn nhiều rãnh; 5. Hạt phấn 4 rãnh;
6. Hạt phấn 3 rãnh; 7. Hạt phấn 1 rãnh; 8.Hạt phấn không rãnh
7.4.1.1 Xử lý các đối tượng trước lúc cố định
Trong một số trường hợp khó đếm số lượng thể nhiễm sắc hoặc thể nhiễm sắc quá dài thì trước khi cố định phải xử lý rễ hay mầm lá, đỉnh sinh trưởng của thân qua một số thuốc như 8 - oxyquinolin, chloranhydrat, consixin, paradichlorobenzen hoặc làm lạnh.
Đối tượng sau khi ngắt khỏi cơ thể thực vật phải cho ngay vào dung dịch 8 - oxyquinolin ở nồng độ 0,002 M ở nhiệt độ 10-14oC trong khoảng 3 giờ. Trong trường hợp này người ta pha dung dịch như sau: dùng 0,58 g 8 - oxyquinolin hòa vào 200 ml nước cất ấm. Xử lý bằng chất này để làm tăng độ lớn của thể nhiễm sắc lên 1,5 lần mà không làm thay đổi chiều dài của chỳng, đồng thời làm cho cỏc eo sơ cấp và thứ cấp hiện rừ hơn.
Muốn xem thể nhiễm sắc dễ dàng và chính xác thì trước khi xử lý đối tượng cần làm lạnh ở 0oC trong 24 giờ vì lúc đó thể nhiễm sắc sẽ co ngắn đáng kể. Kagava đã ngâm trong dung dịch chloranhydrat 0,3 - 1% để làm ngắn thể nhiễm sắc sau đó cho vào nước cất để rửa trong một giờ và tiếp tục cho vào buồng ấm 2 - 4 giờ rồi mới cho vào dung dịch cố định. Những năm gần đây người ta sử dụng dung dịch Consixin 0,01 - 0,05% để xử lý trong thời gian 2 giờ trước khi cố định.
Đối với lá non người ta ngâm trong dung dịch consixin 0,2% trong 1 - 2 giờ.
Người ta cũng có thể dùng dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc để xử lý rễ ở nhiệt độ 12 - 16oC trong 2 - 3 giờ. Để có dung dịch này chúng ta lấy 5 - 10 g tinh thể paradiclorobenzen hòa tan trong 500 ml nước cất để trong bình đậy kín đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 60oC trong 10 - 12 giờ.
Để phân tích kiểu nhân người ta thường xử lý dung dịch consixin kết hợp với hỗn hợp dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc và 8 - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 2 giờ. Hai dung dịch này pha trong tủ ấm ở 60oC.
Để nghiên cứu hình thái thể nhiễm sắc đôi khi trước khi cố định người ta xử lý theo một trong các phương pháp sau:
1. Ngâm vào dung dịch cumarin 2% trong 2 giờ ở nhiệt độ 12-16oC
2. Ngâm vào hỗn hợp dung dịch cumarin 2% và 8 - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 2 giờ ở nhiệt độ 16oC (Nikolop Daxcalop, 1966).
7.4.1.2 Cố định vật mẫu
Vật mẫu sau khi đã được xử lý được chuyển vào dung dịch cố định trong một khoảng thời gian nhất định tùy thuộc vào các dung dịch khác nhau. Khi tiến hành cố định cần chú ý một số nguyên tắc:
1. Lượng dung dịch để cố định phải nhiều hơn khối lượng của vật mẫu cố định 50 - 100 lần.
2. Cố định vật mẫu ngay sau khi vừa tách vật mẫu ra khỏi cơ thể cây, không được tiến hành việc cố định ngoài ánh nắng.
3. Đối với vật mẫu lớn phải tách nhỏ hoặc bỏ những bộ phận không cần thiết trước khi cố định.
4. Trước khi lấy mẫu ra khỏi cây phải tạo mọi điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, về độ ẩm để thúc đẩy quá trình phân chia tế bào như tưới nước, để ở nhiệt độ 20 - 25oC.
5. Phải chuẩn bị các ống nghiệm, tốt nhất là các lọ penicilin hay lọ nút nhám có nh•n đầy đủ. Nh•n trên lọ phải khớp nh•n trên đĩa petri, trên chậu hay trên đồng ruộng.
6. Nếu cây trồng trong chậu thì dùng tay trái lật ngược chậu lên và dùng tay phải bỏ chậu ra. Cỏc rễ mới mọc sẽ bỏm trắng xung quanh bồn đất. Dựng kộo cắt cỏc rễ non trắng nừn, khoắng vào chậu nước cho sạch đất rồi nhúng ngay vào dung dịch xử lý hay dung dịch cố định. Nếu gieo hạt trong đĩa petri thì dùng panh và kim mũi mác để ngắt rễ. Mỗi lần ngắt xong cho ngay vào dung dịch xử lý hay dung dịch cố định.
Hiện nay có nhiều loại dung dịch cố định khác nhau. Về nguyên tắc các dung dịch này có tác dụng làm cho tế bào thực vật chết một cách nhanh chóng mà không gây ảnh hưởng đến số lượng và hình thái thể nhiễm sắc của tế bào. Để nghiên cứu thể nhiễm sắc người ta thường dùng nhất dung dịch Navasin và Cacnua. Tất cả các thuốc cố định hoặc được pha trong cồn hoặc được pha trong nước. Thuốc pha trong cồn thường ngấm nhanh hơn nên chỉ giữ vật mẫu trong đó từ 30 phút đến 12 giờ, còn thuốc pha trong nước mức độ ngấm vào mô chậm hơn do đó có thể giữ trong đó đến 24 giờ hay lâu hơn nữa.
* Dung dịch Navasin 10:4:1
Dung dịch này được sử dụng phổ biến hiện nay. Thời gian cố định các rễ non là 24 giờ trong tối.
Thành phần:
• Axit cromic 10% : 10 phần
• Foocmalin 16% tức là foocmalin thị trường 40% : 4 phần
• Axit axêtic đã kết băng: 1 phần
Thuốc này chỉ pha ngay trước khi dùng vì rất nhanh hỏng. Đây là thuốc có tác dụng rất dịu và giữ được cấu trúc của thể nhiễm sắc tốt.
* Dung dịch Cacnua 6 : 3 : 1 :
Dung dịch này được sử dụng phổ biến hơn. Thời gian cố định từ 2 - 12 giờ.
Thành phần:
• Cồn êtylic 96% hay 100%: 6 phần
• Clorôphooc: 3 phần
• Axit axêtic đã kết băng: 1 phần
* Dung dịch Clac (còn gọi là dung dịch Cacnua cải tiến 3 : 1) Thời gian cố định 2 - 12 giờ đôi khi có thể để lâu hơn, nhiệt độ 0-3oC Thành phần:
• Cồn êtylic 96 độ hay 100 độ : 3 phần
• Axit axêtic đã kết băng : 1 phần
Ba loại dung dịch trên đây được sử dụng phổ biến nhất hiện nay vừa đơn giản, vừa dễ kiếm. Ngoài ra hiện nay đối với đối tượng thực vật có thể dùng các công thức sau (Sacma, 1965):
1) - Axit propionic: 1 phần - Cồn êtylic 95 độ: 3 phần hoặc : - Axit propionic: 100 ml - Cồn êtylic 95 độ: 100ml
- Hydroxit sắt : 0,4 g 2) - Axit propionic: 1phần
- Clorophooc: 4 phần - Cồn êtylic 95 độ: 8 phần 3) - Phoocmalin: 1 phần
- Cồn êtylic 95 độ: 15 phần - Axit propionic: 1 phần
Dung dịch thứ 3 này có tác dụng trong 1 - 2 giờ và được dùng cho thực vật lẫn động vật.
7.4.1.3 Rửa vật mẫu
Sau khi cố định xong vật mẫu cần được rửa sạch thuốc cố định. Đối với thuốc pha trong nước người ta cho vật mẫu lẫn nh•n vào túi vải màn rồi cuộn lại ngâm vào trong cốc thủy tinh chứa nước và phía trên được đặt một vòi nước chảy liên tục. Thời gian rửa 1 - 2 giờ trong mùa hè, 2 - 3 giờ trong mùa đông. Sau khi rửa xong phải làm mất nước bằng cách cho vào dung dịch cồn êtylic theo từng mức độ 20%, 40%, 60%, 80%. Mỗi lần ngâm trong thời gian 30 phút mục đích để cho vật mẫu không bị quăn lại trong khi làm mất nước. Sau khi làm mất nước người ta có thể giữ vật mẫu lâu dài trong cồn 80%.
Đối với thuốc cố định pha cồn thì vật mẫu sau khi cố định xong được rửa sạch trong cồn 80% mỗi lần 1 - 2 giờ cho đến khi hết mùi axit axêtic. Muốn thế người ta dùng vải màn bịt lọ rồi đổ thuốc ra và đổ cồn 80% vào, sau 1 - 2 giờ lại thay cồn 1 lần. Vật mẫu đã rửa sạch có thể giữ lâu dài trong cồn 80%. Để đơn giản người ta có thể rửa vật mẫu bằng nước cất rồi giữ vật mẫu trong tủ lạnh.
7.4.1.4 Làm mủn vật mẫu
Giai đoạn này rất quan trọng nhất là đối với vật mẫu chuẩn bị làm tiêu bản ép. Để làm mủn người ta dùng axit axêtic 45%, axit propionic 40 - 45%, chloranhydrat, axit chlohydric 1N hoặc các enzym. ở đây chúng tôi giới thiệu phương pháp đơn giản và dễ làm như sau: Sau khi rửa vật mẫu bằng nước cất liền cho vật mẫu ngâm vào dung dịch HCl 1N trong 5 phút (dung dịch HCl 1N được chuẩn bị như sau: Lấy 82,5 ml HCl tỷ trọng 1,19 cho nước cất vào tới mức 1000 ml) Sau đó tiếp tục cho vật mẫu vào dung dịch HCl: H2O (tỷ lệ 1 : 1) trong thời gian 20 phút. Rửa vật mẫu trong nước theo phương pháp trên.
7.4.1.5 Nhuộm vật mẫu
Phương pháp nhuộm vật mẫu để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc có nhiều, ở đây chúng tôi chỉ giới thiệu hai phương pháp chính dễ sử dụng và cho kết quả tốt:
1. Nhuộm bằng axêtôcacmin
Chuẩn bị thuốc nhuộm: lấy 1 g cacmin hòa vào 45 ml axit axêtic đã kết băng và 55 ml nước cất. Việc hòa tan được tiến hành trong bình cầu có thiết bị làm nguội, đặt bình cầu trên bếp, đun cách thủy trong thời gian 30 - 60 phút, nếu không có thiết bị làm nguội thì đậy bằng một cái phễu trước khi đặt lên bếp.
Dung dịch axêtocacmin có màu đỏ tối, sau khi làm lạnh thì được lọc và đổ vào lọ đậy nút nhám (cặn trên giấy lọc có thể sử dụng lại cho lần sau).
Theo Snao (1953) có thể chuẩn bị cacmin trong cồn êtylic có thêm HCl. Muốn vậy thì lấy 4 g cacmin hòa tan vào 15 ml nước nóng cho thêm 1ml HCl để nguội rồi đổ vào 95 ml cồn 85% rồi lọc.
Cách nhuộm: Cho vật mẫu vào dung dịch thuốc nhuộm trong 5 phút, rửa trong nước rồi chuyển vào dung dịch phèn sắt amôni 3 - 5% và hơ nóng cho đến bốc hơi.
2. Nhuộm bằng hêmatôxylin:
Chuẩn bị thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm hêmatôxylin có nhiều công thức nhưng để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc, chúng tôi giới thiệu công thức của Gormôri vừa đơn giản vừa dễ làm:
* 1 g hêmatôxylin hòa tan trong 100 ml nước;
* 3 g phèn crôm hòa tan trong 100 ml nước;
* 4 ml crômat kali hoặc bicrômat kali;
* 4 ml H2S04 5%.
Nếu hêmatôxylin có dạng hạt, trước hết hòa tan với một ít cồn sau khi đã hòa tan riêng biệt từng loại một ta lần lượt hỗn hợp lại 4 thứ với nhau theo thứ tự như sau: Phèn crôm - hêmatôxylin - crômat kali - H2S04 dung dịch được để yên 2 - 3 ngày sau mới được sử dụng.
Thời gian sử dụng thuốc từ 4 - 8 tuần lễ.
Cách sử dụng: Vật mẫu sau khi đã làm mủn trong HCl rửa vật mẫu bằng nước cất rồi cho ngâm vào dung dịch hêmatôxylin để trong tủ ấm 60oC trong thời gian 20 - 30 phút.
7.4.1.6 Làm tiêu bản tạm thời
Sau khi nhuộm vật mẫu, vớt vật mẫu ra cho vào lọ nước cất và có thể giữ lâu dài ở đó trong nhiệt độ 30oC. Vật mẫu được vớt lên bản kính đặt trong một giọt axit axêtic 45% gạt bỏ phần thừa rồi đậy phiến kính lên một cách nhẹ nhàng tránh các bọt khí, dùng que diêm hay đầu của kim mũi mác ấn nhẹ làm cho vật mẫu dát mỏng đều đặn và từ từ. Nếu vật mẫu cứng khó dát mỏng thì trước đó cần hơ qua trên đèn cồn để cho vật mẫu mềm ra (chú ý khi hơ tránh làm khô nước axit axêtic dưới phiến kính). Khi dát xong trên phiến kính, quan sát từ bộ giác nhỏ đến bộ giỏc lớn để tỡm những tế bào đang cú cỏc thể nhiễm sắc tỏch rời nhau rừ nhất và cú bộ thể nhiễm sắc hiện cấu trỳc rừ nhất và đầy đủ nhất.
7.4.1.7 Chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định
Trong thực tế có nhiều phương pháp chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định.
Phương pháp đơn giản nhất dùng khí cacbonic để làm rắn tiêu bản. Quá trình tiến hành như sau: Sau khi đã quan sát thấy rằng tiêu bản tạm thời tốt thì chuyển ngay sang giai đoạn cố định bằng cách mở van bình khí cacbonic xì vào mặt lưng của tiêu bản, nước trong tiêu bản, kết tinh lại và tiêu bản hóa đá, lấy lưỡi dao cạo râu tách phiến kính ra khỏi bản kính, dùng cặp con kẹp lấy phiến kính rồi cho cả bản kính và phiến kính vào lọ cồn 96o - 100o. Sau 10 - 30 phút vớt ra hong khô bằng không khí trong phòng. Vật mẫu được dán bằng Euparon. Nếu không có Euparon thì phải dán bằng keo Canada.
Cách tiến hành có thể thay đổi như sau: Vật mẫu ngâm trong cồn 96o từ 2 - 3 phút rồi chuyển sang cồn 100o trong 2 - 5 phút, cồn 100o và Xylen từ 2 - 5 phút, cuối cùng chuyển vào Xylen, sau đó dán tiêu bản bằng keo Canađa.
1 2 3 4 5 6
C
Hình 7.13.
Hình ảnh NST từ tiêu bản (A), vẽ lại (B) và sơ đồ hóa (C) (theo Stace 1996)
7.4.1.8 Xác định vị trí tế bào và đo đếm, chụp ảnh thể nhiễm sắc
Sau khi đã dán tiêu bản và hong khô cho tiêu bản lên kính hiển vi có đầy đủ 3 vật kính.
Quan sỏt từ vật kớnh nhỏ đến vật kớnh lớn để xỏc định cỏc tế bào chứa cỏc thể nhiễm sắc rừ và thể hiện cấu trúc tốt nhất rồi dựa vào thước đo trên bàn kính hiển vi để đánh dấu số hiệu mẫu nghiên cứu và số hiệu của vị trí các tế bào tốt được ghi vào một nh•n con được dán vào một đầu của bản kính.
Các bước nghiên cứu trước hết tiến hành đếm số lượng thể nhiễm sắc trên nhiều tế bào của một tiêu bản và trên nhiều tiêu bản để khẳng định một cách chính xác. Mỗi loài cần được thu mẫu và tiến hành nghiên cứu trên nhiều địa điểm cách xa nhau, ít nhất từ 3 địa điểm trở lên.
Sau khi đã khẳng định chính xác số lượng thể nhiễm sắc của loài thì sang bước 2 tiến hành xác định tế bào thể hiện hình thái thể nhiễm sắc tốt nhất rồi tiến hành vẽ hay chụp ảnh. Để vẽ hình thái thể nhiễm sắc người ta dùng dụng cụ vẽ PA - 4 lắp trên ống nối của kính hiển vi.
Bờn cạnh ảnh chụp thỡ việc vẽ hỡnh rất cần thiết vỡ nú phản ảnh đầy đủ rừ nột những dấu hiệu nằm ở độ sâu khác nhau mà ảnh chụp không tài nào thể hiện được. Ngoài việc vẽ và chụp ảnh người ta còn tiến hành đo kích thước thể nhiễm sắc bằng cách lắp trắc vi vật kích và trắc vì thị kính vào kính hiển vi nhưng đòi hỏi khi tiến hành thí nghiệm cần phải thống nhất các bước và thời gian thu mẫu, thời gian xử lý, thời gian cố định cũng như thời gian nhuộm...
7.4.2 Hình thái thể nhiễm sắc
Chỳng ta cú thể quan sỏt rừ hỡnh thỏi thể nhiễm sắc ở pha giữa (metaphase) của sự phõn bào vỡ giai đoạn này hỡnh thỏi và cấu trỳc thể thể nhiễm sắc hiện rừ nhất đú là lỳc mà thể nhiễm sắc đông đặc nhất và dễ bắt màu nhất.
Thể nhiễm sắc có hình que, hình chữ I hay hình chữ V có một chỗ eo gọi là eo cấp I chia thể nhiễm sắc thành 2 vai. Vị trí đó tương ứng với vị trí của tâm động (centromere). Tuỳ theo vị trí của tâm động mà người ta phân biệt các thể nhiễm sắc thành các kiểu khác nhau. Theo Levan et al. (1965, ghi theo Clive A. Stace, 1996) đã đưa ra thang phân chia loại nhiễm sắc thể theo tỉ lệ của vai dài so với vai ngắn, theo đó:
M (m): 1 - 1,7; Sm: 1,7 - 3; SA: 3 - 7; A: 7 * * và T: *
7.4.2.1 Thể nhiễm sắc tâm cùng (Telocentric) kí hiệu T
Là thể nhiễm sắc có tâm động ở tận cùng, vì thế thể nhiễm sắc bao gồm chỉ một vai. Loại này ít gặp ở thực vật.
7.4.2.2 Thể nhiễm sắc tâm mút (Acrocentric) kí hiệu A
Là thể sắc có tâm động ở gần về một đầu vì thế thể nhiễm sắc gồm 2 vai: vai dài và vai ngắn và tỷ lệ giữa vai dài và vai ngắn từ 7 - ∞
Hình 7.14.
Hình thái và các kiểu nhiễm sắc thể (Levan et al. theo Stace 1996)
7.4.2.3 Thể nhiễm sắc tâm cận mút (Subacrocentric) kí hiệu Sa
Là thể sắc có tâm động ở gần về một đầu vì thế thể nhiễm sắc gồm 2 vai: vai dài và vai ngắn và tỷ lệ giữa vai dài và vai ngắn từ 3 - 7.
7.4.2.4 Thể nhiễm sắc tâm cận lệch (submetacentric) kí hiệu Sm
Là thể nhiễm sắc có tâm động nằm lệch xa khỏi điểm trung tâm, tỉ lệ vai dài và vai ngắn là 1,7 - 3,0.
7.4.2.5 Thể nhiễm sắc tâm giữa (Metacentric) kí hiệu M (m)
Là thể nhiễm sắc có tâm động nằm ở khoảng giữa, tỷ lệ của vai dài so với vai ngắn khoảng 1 - 1,7 (kí hiệu m), trong trường hợp tỉ lệ đó bằng 1 thì được gọi là thể nhiễm sắc tâm cân (M).
Sơ đồ hóa hình thái thể nhiễm sắc được trình bày trong hình 7.14 trên. Một số thể nhiễm sắc có thêm eo thứ 2. Eo này thường nằm ở phần cuối của một vai ở một số khác ở tận cùng thể nhiễm sắc có mang một phần phụ hình cầu hay hình dài gọi là thể kèm. Thể kèm được nối với phần chính bởi một sợi nhỏ và vì không có axit Thymenucleic (sine acido thymonucleico) trong đó nên có tên gọi thể nhiễm sắc SAT; thật ra trong đó vẫn có ADN như trong phần chính của thể nhiễm sắc (Gây, 1931). Đối với tất cả các tế bào của cơ thể thì thể nhiễm sắc có hình dạng không đổi và cũng cố định đối với loài và cả chi nữa. Vị trí tâm động, chiều dài các vai, eo cấp 2 và thể kèm qui định đặc tính cá biệt của từng thể nhiễm sắc và ngay cả từng loài nữa.
Bên cạnh các thể nhiễm sắc bình thường như đã trình bày ở trên gọi là thể nhiễm sắc A, ở một số loài và ngay một số cá thể trong cùng một loài người ta còn thấy xuất hiện một số thể