2.1.1. Đối tợng nghiên cứu.
Đối tợng nghiên cứu cho cả thử nghiệm lâm sàng và đánh giá kháng chloroquin là tất cả các bệnh nhân đợc chẩn đoán Sốt rét do P.
falciparum cha có biến chứng tại địa điểm nghiên cứu với các tiêu chuẩn lâm
sàng và xét nghiệm sau:
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn.
- Từ 6 tháng tuổi - 60 tuổi.
- Có sốt với nhiệt độ cặp nách > 37, 50 C hoặc có tiền sử sốt trong vòng 24 giờ trớc đó.
- Nhiễm đơn thuần P.falciparum
- Mật độ KST thể vô tính trong máu từ 1000 - 200.000 KST/ mm3
- Có thể uống đợc thuốc
- Có cam kết đồng ý tham gia nghiên cứu của bản thân hoặc của bố, mẹ, ngời bảo trợ nếu là trẻ em
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ :
- Trẻ dới 6 tháng tuổi hoăc ngời lớn trên 60 tuổi.
- Có các dấu hiệu của SR nặng, biến chứng (Phụ lục 1)
- Nhiễm phối hợp hoặc nhiễm đơn các loài Plasmodium khác - Mật độ KST trong máu < 500KST/mm3 hoặc > 200.000KST/mm3
- Trẻ suy dinh dỡng nặng
- Đang sốt do mắc các bệnh cấp tính (Viêm nhiễm cấp tính do vi khuẩn, Sốt xuất huyết, Sôt phát ban)
- Mắc bệnh mãn tính, HIV
- Có tiền sử mẫn cảm với 1 trong hai thành phần của Arterakin
- Bệnh nhân cũng sẽ bị loại khi trớc đó hoặc trong quá trình nghiên cứu dùng các thuốc chống SR khác bằng thử nớc tiểu (Phụ lục 8)
Trong trờng hợp xuất hiện các triệu chứng nặng của SRAT trong quá trình nghiên cứu thì đợc phép dùng AS đờng tiêm tĩnh mạch theo quy định của Bộ Y tế và loại khỏi nghiên cứu.
2.1.4 Thòi gian, địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài:
Nghiên cứu đợc tiến hành trong 3 năm 2008-2010 với 2 giai đoạn: Giai doạn giám sát hiệu lực thuốc trên thực địa theo qui trình 28 ngay và giai đoạn nghiên cứu trong labo
Địa điểm thực hiện đề tài:
- Giám sát hiệu lực thuốc và theo dõi tại thực địa theo quy trình 28 ngàyđợc tiến hành tại 2 khu vực có SR lu hành là Miền Trung và Tây Nguyên. Tại 2 tỉnh có tỷ lệ P.falciparum kháng CQ cao là Quảng Trị giáp với Lào và Đăk Nông giáp với Campuchia
o Tỉnh Quảng Trị - Huyện Hớng Hoá
o Tỉnh Đăk Nông - Huyện Dakmil, Dak Song, Czut
- Thực hiện kĩ thuật PCR trong đánh giá kháng CQ và phân biệt tái phat, tái nhiễm tại Khoa Sinh học phân tử Viện SR - KST - CT TƯ
2.1.5. Vân đề đạo đức trong nghiên cứuSự tự nguyện. Sự tự nguyện.
- Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều đợc giải thích rõ về mục đích nghiên cứu, và quy trình theo dõi và tự nguyện tham gia.
- Đợc kí cam kết tự nguyện tham gia.
- Nếu là trẻ em dới 16 tuổi cần có sự đồng ý của bố, mẹ hoặc ngời bảo trợ ( Phụ lục 10 )
Các dịch vụ chăm sóc sức khoẻ.
- Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu sẽ đợc cung cấp thuốc điều trị SR miễn phí.
- Đợc cung cấp dịch truyền, gói ORS và các loại vitamin bổ trợ miễn phí
- Trong trờng hợp có phản ứng phụ, ngời bệnh sẽ đợc cho thuốc hoặc đa đi bệnh viện mà không phải chịu bất cứ phí tổn nào và đợc chăm sóc cho đến khi bình phục.
- Đối với các bệnh nhân không đủ tiêu chuẩn lựa chọn nhng có KSTSR trong máu thì vẫn đợc điều trị miễn phí bằng thuốc SR theo quy định hiện hành của Bộ Y tế.
- Các bệnh nhân đợc phát hiện những vấn đề về sức khoẻ trong qúa trình sàng lọc mặc dù không liên quan đến SR sẽ đợc t vấn đi khám, chữa bệnh ở những cơ sở y tế phù hợp
- Những vấn đề sức khoẻ là những bí mật cá nhân dợc phát hiện qua khám lâm sàng, xét nghiệm nh mắc các bệnh xã hội, viêm gan, HIV v.v sẽ đợc giữ kín và đợc t vấn về bệnh tật, cũng nh giới thiệu tới những cơ sở y tế phù hợp.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu 2.2.1- Thiết kế nghiên cứu. 2.2.1- Thiết kế nghiên cứu.
Đây là một nghiên cứu mô tả, cắt ngang theo kiểu thử nghiệm lâm sàng mở, không đối chứng (one arm). Một trong các phơng pháp giám sát hiệu lực điều trị của thuốc sốt rét của WHO 2005, gồm 2 phần.
- Giám sát hiệu lực điều trị của Arterakin trên bệnh nhân SR do P.
falciparum cha biến chứng theo qui trình 28 ngày của WHO. Có sử dụng kĩ
thuật PCR để xác định tái phát-tái nhiễm.
- Đánh giá tình trạng kháng CQ của P. fanciprum trên invitro từ các mẫu máu của bệnh nhân trong phần giám sát hiệu lực thuốc bằng PCR để xác định đột biến điểm 76 trên gen Pfcrt, điểm quyết định tính kháng CQ.
2.2.2- Phơng pháp chọn mẫu.
Đối với đánh giá hiệu lc của Arterakin trên lâm sàng:
Chọn các bệnh nhân có sốt tại các điểm trên, nếu có đủ các tiêu chuẩn trong mục 2.1.2 và 2.1.3 sẽ đợc da vào nghiên cứu.
Đối với đánh giá kháng chloroquin trên invitro:
Là tất cả các mẫu máu tơng ứng với các bệnh nhân đã đợc lựa chọn vào nghiên cứu hiệu lực của Arterakin nói trên.
Cỡ mẫu :
Qua các nghiên cứu của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ơng cho thấy tỷ lệ thất bại điều trị trong các nghiên cứu với phối hợp thuốc dihydroartemisinin - piperaquin khoảng < 5%. Với độ tin cậy là 95% (p = 0,05), độ chính xác d là 10% thì cỡ mẫu cho nghiên cứu loại này đợc tính theo bảng qui định cỡ mẫu năm 1987 dới đây.
Bảng 2.1. Tính cỡ mẫu theo quy định của WHO
Tỷ lệ quần thể (P) cho trước, mức độ tin cậy 95%
d 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50
0.05 73 138 196 246 288 323 350 369 380 384
0.10 18a 35a 49a 61 72 81 87 92 95 96
Nh vậy đối chiếu với bảng trên ta có cỡ mẫu là 18 bệnh nhân, cộng với 20% bệnh nhân có thể bị thất lạc là 4, ta có 22 bệnh nhân. Nhng đê mẫu có tính chất đại diện, số bệnh nhân nghiên cứu tại mỗi tỉnh sẽ bằng 50. Cỡ mẫu cho nghiên cứu này tại 2 tỉnh sẽ là ≥ 100 bệnh nhân.
Cỡ mẫu này cũng đồng thời sử dụng cho đánh giá kháng chloroquin bằng PCR. Nh vậy tổng số mẫu máu sẽ là ≥ 100 mẫu cho nghiên cứu phát hiện đột biến kháng CQ.
2.2.3.Thuốc và phác đồ dùng cho nghiên cứu
Thuốc Arterakin:
Viờn Arterakin chứa 40 mg dihydroartemisinin (DHA) và 320 mg piperaquin (PIP) do xớ nghiệp dược phẩm trung ương I sản xuất. Tất cả cỏc điểm sẽ cựng sử dụng 1 lụ do XNDP Trung uong 1 sản xuất, Số lô Botch.N0, ngày sản xuất 03/11/2008, hạn sử dụng tháng 11/2011 và được kiểm tra chất lượng tại Viện kiểm nghiệm Quốc gia.
Các thuốc khác dùng cho điều trị triệu chứng:
- Pracetamol dạng viên dùng khi trẻ dới 7 tuổi sốt > 3805 - Gói ORS,
Các thuốc dùng khi có biến chứng:
- Dịch truyền đẳng trơng (Glucoza 5%, Natriclorid 0,9%, Ringerlactat) trong trờng hợp xuất hiện những dấu hiệu biến chứng nặng.
- Thuốc artesunat dạng tiêm tĩnh mạch 60 mg/lọ (khi bệnh nhân nôn nhiều hoặc chuyển sang SRAT).
- Các thuốc chống dị ứng (khi có phát ban, mẩn ngứa).
Phác đồ điều trị:
Bảng 2.2. Liều Arterakin tính theo nhóm tuổi
(Bộ Y Tế 2008)
Nhóm tuổi Số lượng viờn (Arterakin ) trong ng y™ à
0 giờ 8 giờ 24 giờ 48 giờ
2 - 3 tuổi 0.5 0.5 0.5 0.5
3 - < 8 tuổi 1.0 1.0 1.0 1.0
8 - < 15 tuổi 1.5 1.5 1.5 1.5
≥ 15 tuổi 2.0 2.0 2.0 2.0
Bảng 2.2 là phác đồ theo hớng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh sốt rét của Bộ y tế năm 2008 [3].
Tất cả liều thuốc được uống dưới sự giỏm sỏt của cỏn bộ cú chuyờn mụn. Quan sỏt bệnh nhõn trong 30 phỳt sau khi cho uống thuốc xem cú tỏc dụng phụ hoặc cú nụn khụng. Bệnh nhõn nào bị nụn trong thời gian này sẽ được uống lại thuốc với cựng liều và quan sỏt tiếp trong 30 phỳt nữa. Nếu bệnh nhõn lại nụn loại bệnh nhõn đú ra khỏi nghiờn cứu và cho điều trị bằng thuốc artesunat tiờm phối hợp doxycyclin (hoặc clindamycin) như hướng đẫn của Bộ Y tế.
2.2.4. Quy trình tiến hành nghiên cứu và theo dõi.
2.2.4.1. Quy trình đánh giá hiệu lực Arterakin trên lâm sàng
Nghiên cứu đợc tiến hành theo qui trình 28 ngày của Tổ chức y tế thế giới - WHO/MAL/96.1077 (Phụ lục 5).
Bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn sẽ đợc lập danh sách nghiên cứu. KST và nhiệt độ đợc theo dõi ngày 1 lần cho đến khi hết sốt và sạch KST trong 2 ngày liên tiếp. Ghi đầy đủ trong bệnh án các thông số theo dõi, các dấu hiệu lâm sàng, các chỉ số xét nghiệm và các triệu chứng phụ. Sau đó hàng tuần bệnh nhân đợc kiểm tra lại nhiệt độ, KSTSR vào các ngày D7,D14D,21D,28.
- Lam máu đựoc soi tìm KST. Đếm số lợng KST từ 2 ngời độc lập, sau đó đợc mã hoá theo địa điểm và ngày lấy lam máu từ D0 - D28
- Làm PCR mẫu máu ngày D0 để loại trừ đồng nhiễm P. vivax
- Nếu ngày D3 cha sạch ký sinh trùng phải lấy thêm mẫu máu vào các ngày D4 , D5…( chỉ dừng khi 2 ngày liên tiếp âm tính).
- Nếu có sốt lại trong bất kì ngày nào từ D7- D,28 thì ngời bệnh sẽ đợc khám và lấy máu tìm KST và làm PCR lại nh ngày D0.
- Nếu có KST sẽ đợc điều trị lại và lấy máu làm PCR để phân biệt tái phát, tái nhiễm theo qui trình.
Ngày D0 .
- Đo thân nhiệt (trên 37,50 C là sốt) - Cân nặng
- Lấy máu xét nghiệm : Tìm mật độ KSTSR (≥ 1000/mm3), làm PCR - Hỏi về tiền sử bệnh tật.
- Khám toàn thân loại trừ suy dinh dỡng, các bệnh cấp và mãn tính khác do vi khuẩn, vi rus.
- Thử nớc tiểu phát hiện thuốc SR trong nớc tiểu theo phơng pháp Dill - Glazco và Linin (Phụ lục 8).
- Thử nớc tiểu phát hiện có thai với phụ nữ từ 15 tuổi trở lên. - Ký cam kết tham gia một cách tự nguyện.
- Uống thuốc theo liều lợng, thời gian quy định.
Ngày D1
- Đo thân nhiệt.
- Khám, phát hiện, xử trí các tác dụng phụ nếu có. - Lấy máu làm xét nghiệm: Xác định mật độ KSTSR. - Cho uống thuốc theo phác đồ.
Ngày D2
- Đo thân nhiệt.
- Khám, xử trí cấc tác dung phụ.
- Lấy máu làm xét nghiệm: tìm mật độ KST. - Cho uống thuốc theo phác đồ.
Ngày D3
- Đo thân nhiệt.
- Khám, xử trí cấc tác dung phụ. - Lấy máu làm xét nghiệm tìm KST.
Ngày D4
- Đo thân nhiệt.
- Khám, xử trí cấc tác dung phụ. - Lấy máu làm xét nghiệm tìm KST.
Ngày D7,D14D,21D,28
- Đo thân nhiệt.
Bảng 2.3. Tóm tắt quy trình theo dõi từ D0 - D,2 Ngày D0 D1 D2 D3 D4 D7 D14 D21 D28 Ngày bất kỳ Khám lâm sàng X X X X X X X Đo nhiệt độ X X X X X X X Xét nghiệm KST X X X X X X X X X X Thử nớc tiểu X Làm bệnh án X Ký cam kết X Lấy mẫu PCR X X X Điều trị X X X X
Tác dụng phụ đợc định nghĩa là sự xuất hiện của bất kì một triệu chứng, dấu hiệu nào không có lợi, nằm ngoài các triệu chứng bệnh, làm tiến triển bệnh xấu đi sau khi sử dụng một thuốc trong thời gian nghiên cứu.
Bảng 2.4. Các tác dụng phụ không mong muốn và xử trí
Dấu hiệu phụ Ngày D0 - D28
Cần phải điêu trị triệu chứng Có ĐT Không ĐT Nhức đàu Mất ngủ Chóng mặt Buồn nôn Nôn Đau bụng Tiêu chảy Mẩn ngứa
2.2.4.2. Quy trình phân biệt tái phát, tái nhiễm bằng PCR
- Lấy máu đầu ngón tay vào giấy thấm Whatman 3MM ngày D0 và ngày sốt lại (từ D14-D28) cho nghiên cứu phân biệt tái phát, tái nhiễm.
- Giấy thấm đợc mã hoá theo mã của lam máu (theo ngày và địa điểm nghiên cứu).
- Bảo quản mỗi mẫu máu trong từng túi nilon riêng, chống ẩm, tránh ánh sáng, giữ ở nhiệt độ – 200 C.
- Xử lý mẫu máu bằng kĩ thuật PCR tại Khoa sinh học phân tử Viện SR - KST- CTTƯ dựa vào phân tích kiểu gen của P. falciprum trên 3 locus gen MSP1, MSP2, và GLURP. Nếu kiểu gen nhận biết ở 3 locus trên có biểu hiện giống hệt nhau là tái phát. Nếu khác nhau chỉ ở một trong ba locus gen trên là nhiễm mới [7], [9].
Các bớc tiến hành nh sau:
Phản ứng Nest 1:
• Đối với locus MSP1 sử dụng đôi mồi có trình tự sau:
M1-OF: 5'- CTA GAA GCT TTA GAA GAT GCA GTA TTG -3' M1-OR: 5'- CTT AAA TAG TAT TCT AAT TCA AGT GGA TCA-3' • Đối với locus MSP2 sử dụng đôi mồi:
M2-OF: 5'- ATG AGG GTA ATT AAA ACA TTA TCT ATT ATA -3' M2-OR: 5'- CTT TGT TAC CAT AGG TAC ATT CTT -3'
• Đối với locus GLURP sử dụng đôi mồi:
G-OF: 5'- TGA ATT TGA AGA TGT TCA CAC TGA AC -3' G-OR: 5'- GTG GAA TTG CTT TTT CTT CAA CAC TAA -3' Thành phần trong một ống phản ứng tổng thể tích 25 àl nh sau: dNTPs (2,0 mM) 2,5 àl
10x PCR buffer (20 mM MgCl2) 2,5 àl Mồi xuôi (1,25 àM) 1,0 àl Mồi ngợc (1,25 àM) 1,0 àl
Dịch chiết ADN 3,0 àl
Điều kiện tối u của phản ứng Nest1 là: Bớc 1 thực hiện 95ºC trong 5 phút, bớc 2 có 30 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 95ºC trong 5 phút, 58ºC trong 2 phút, 72ºC trong 2 phút, và 72ºC trong 8 phút.
Phản ứng Nest2:
Thành phần phản ứng Nest2 nh phản ứng Nest1, chỉ khác ADN khuôn đợc lấy từ sản phẩm Nest1.
• Đối với locus MSP1 sử dụng đôi mồi xác định các kiểu gen đặc hiệu theo K1, MAD20, RO33:
Đôi mồi xác định kiểu gen K1:
M1-2KF:5'- AAATGA AGA AGA AAT TAC TAC AAA AGG TGC -3' M1-2KR: 5'- GCT TGC ATC AGC TGG AGG GCT TGC ACC AGA -3'
Đôi mồi xác định kiểu gen MAD20:
M1-2MF:5'- AAATGA AGG AAC AAG TGG AAC GAC TGT TAC -3' M1-2MR: 5'- ATC TGA AGG ATT TGT ACG TCT TGA ATT ACC -3'
Đôi mồi xác định kiểu gen RO33:
M1-2RF: 5'- TAA AGG ATG GAG CAA ATA CTC AAG TTG TTG -3' M1-2RR: 5'- CAT CTG AAG GAT TTG CAG CAC CTG GCG ATC -3' • Đối với locus MSP2 dụng đôi mồi xác định kiểu gen đặc hiệu theo FC, IC
Đôi mồi xác định kiểu gen FC
M2-FCF : 5'- AAT ACT AAG AGT GTA GGT GCA AAT GCT CCA-3' M2-FCR : 5'- TTT TAT TTG GTG CAT TGC CAG AAC TTG AAC-3'
Đôi mồi xác định kiểu gen IC
M2-ICF : 5'- AGA AGT ATG GCA GAA AGT AAG CCT CCT ACT-3' M2-ICR : 5'- GAT TGT AAT TCG GGG GAT TCA GTT TGT TCG-3'
Điều kiện tối u của phản ứng: Bớc 1là 95ºC trong 5 phút, bớc 2 có 30 chu kỳ gồm 94ºC trong 1 phút, 61ºC trong 1 phút, 72ºC trong 2 phút, và 72ºC trong 8 phút.
• Đối với locus GLURP sử dụng đôi mồi xác định kiểu gen đặc hiệu là: G-FN: 5'- TGT TCA CAC TGA ACA ATT AGA TTT AGA TCA -3' G-OR: 5'- GTG GAA TTG CTT TTT CTT CAA CAC TAA -3'
Điều kiện tối u của phản ứng Nest2 : Bớc 1là 95ºC trong 5 phút, bớc 2 có 30 chu kỳ gồm 94ºC trong 1 phút, 58ºC trong 2 phút, 72ºC trong 2 phút, và 72ºC trong 8 phút. Thành phần của Nest2 chỉ khác Nest1 là ADN khuôn đợc lấy từ sản phẩm của Nest1.
Dựa vào phân tích kết quả kích thớc các alen trong 3 locus gen đa hình