chloroquin tại điểm 76 bằng PCR
• Tách chiết ADN:
Kĩ thuật của Plowe và cs năm 1995, kĩ thuật này hay đợc sử dụng.
- Cắt mẫu máu bệnh nhân trên giấy thấm Whatman thành nhiều mảnh nhỏ rồi bỏ vào ống nhựa có dung tích 1,5ml
- Thêm vào ống chứa sinh phẩm 1ml hỗn dịch gồm Saponin 0,5% và PBS có pH 7,4.
- ủ ở nhiệt độ 37˚C trong 30ph. - Ly tâm tốc độ cao loại bỏ dịch nổi.
- Rửa 3 lần với 1ml/ lần dung dịch PBS ph 7,4.
- Thêm và ống sinh phẩm 150àl 10% dung dịch Chelex- 100. - Đun sôi trong 8 phút.
- Ly tâm lấy dịch nổi.
- Bảo quản ở -20˚C cho tới khi sử dụng.
Kĩ thuật Wooden năm 1993. Kĩ thuật này đợc sử dụng khi máu trên giấy thấm không bị Saponin ly giải hết.
- Cắt mẫu máu bệnh nhân trên giấy thấm Whatman thành nhiều mảnh nhỏ rồi bỏ vào ống nhựa có dung tích 1,5ml.
- Thêm 200ml dung dịch đệm PBS vào ống.
- Thêm một lợng SDS 10% ( Sodium dodecyl sulfate ) sao cho nồng độ cuối cùng đạt 0,5%.
- Thêm proteinase K sao cho nồng độ cuối cùng đạt 500àg/ml. - ủ ở 37˚C trong 3 giờ.
- Phân lập 3 lần bằng hỗn dịch Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol theo tỷ lệ 25/24/1.
- Tủa bằng Ethanol tuyệt đối 99% qua đêm. - Ly tâm loại bỏ phần Ethanol nỏi.
- Rửa 2 lần bằng Ethanol 75%.
- Ly tâm tốc độ cao lấy phần ADN lắng dới đáy ống. - Đặt trong tủ ấm 57˚C trong 15ph.
- Thêm 50 àl dung dịch TE (10mM Tris: 1mM DETA) để ở 4˚C qua một đêm.
- Bảo quản ở -20˚C đến khi sử dụng.
• Thực hiên phản ứng PCR trên máy:
Mẫu máu bệnh nhân trên giấy thấm đợc sử dụng để phân biệt tái phát hoặc tái nhiễm dựa vào phân tích kiểu gen trên 3 locus gen MSP1, MSP2, GLURP và xác định đột biến kháng thuốc của P.falciparum tại điểm 76 bằng:
- Máy luân nhiệt Eppendorf của Đức.