Phơng pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) đợc Karry Mullis- nhà hoá sinh học ngời Mỹ và cs đề xuất vào năm 1985 và đợc trao giải Nobel năm 1993. Mục đích của phơng pháp này nhằm nhân lên nhiều lần một đoạn ADN cần nghiên cứu trong ống nghiệm. Đoạn ADN cần nghiên cứu sẽ đợc nhân lên theo hàm số mũ 2n. Nhờ có kĩ thuật PCR, ngời ta đã xác định đợc một cách chính xác các loài KSTSR khác nhau dựa vào việc xác định đợc cấu trúc gen đặc thù của loài cùng nhiều ứng dụng quan trọng khác[8].
Điều kiện cần thiết để thực hiện đợc một phản ứng PCR:
- Phân tử ADN cần nhân lên.
- Hai ADN mồi (primers), mỗi mồi có khoảng 20 đôi base, hai mồi này gắn ở hai đầu của phân tử ADN cần nhân lên: mồi ngợc và mồi xuôi. - 4 loại nucleotid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
- Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt độ cao, enzym này đợc tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus[39].
Các giai đoạn của mỗi chu kỳ nhân lên khi chạy PCR (3 giai đoạn):
- Giai đoạn biến tính: Để tách ADN thành 2 sợi đơn. ADN đợc ủ ở 940 C
- Giai đoạn lai ghép: ADN mồi đợc lai ghép với từng sợi đơn của ADN cần nhân lên ở vị trí 5'', 3' . Nhiệt độ tối u cho giai đoạn này là 50-520C
- Giai đoạn tổng hợp ADN: Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp các nucleotid vào sau ADN mồi theo trình tự bổ sung dựa vào khuôn ADN cần nhân lên. Thực hiện ở nhiệt độ 70-720C.
Sau mỗi chu kỳ từ một phân tử ADN ban đầu tạo hai phân tử ADN, Sau 30 chu kỳ từ một phân tử ADN ban đầu sẽ có 230 phân tử đợc tạo thành [7], [29].
Enzym giới hạn - Phân đoạn ADN
Để phân đoạn ADN ngời ta dùng các enzym cắt hay còn gọi enzym giới hạn (Restriction enzyme). Enzym giới hạn có đặc điểm là cắt ADN ở những vị trí xác định. Các loại enzym giới hạn có các đặc điểm sau[39].
- Cắt ADN ở các vị trí xác định.
- Đợc phân lập từ vi khuẩn, tên enzym cắt là tên viết tắt của vi khuẩn. - Vị trí cắt thờng có 4-8 nucleotid sợi đơn tạo thành đầu kết dính.
- Sau khi bị cắt ADN có các đầu kết dính ở các sợi đơn. Khi bị cắt các đầu kết dính của phân tử ADN có các nucleotid bổ sung cho nhau.