2.2.1- Thiết kế nghiên cứu.
Đây là một nghiên cứu mô tả, cắt ngang theo kiểu thử nghiệm lâm sàng mở, không đối chứng (one arm). Một trong các phơng pháp giám sát hiệu lực điều trị của thuốc sốt rét của WHO 2005, gồm 2 phần.
- Giám sát hiệu lực điều trị của Arterakin trên bệnh nhân SR do P.
falciparum cha biến chứng theo qui trình 28 ngày của WHO. Có sử dụng kĩ
thuật PCR để xác định tái phát-tái nhiễm.
- Đánh giá tình trạng kháng CQ của P. fanciprum trên invitro từ các mẫu máu của bệnh nhân trong phần giám sát hiệu lực thuốc bằng PCR để xác định đột biến điểm 76 trên gen Pfcrt, điểm quyết định tính kháng CQ.
2.2.2- Phơng pháp chọn mẫu.
Đối với đánh giá hiệu lc của Arterakin trên lâm sàng:
Chọn các bệnh nhân có sốt tại các điểm trên, nếu có đủ các tiêu chuẩn trong mục 2.1.2 và 2.1.3 sẽ đợc da vào nghiên cứu.
Đối với đánh giá kháng chloroquin trên invitro:
Là tất cả các mẫu máu tơng ứng với các bệnh nhân đã đợc lựa chọn vào nghiên cứu hiệu lực của Arterakin nói trên.
Cỡ mẫu :
Qua các nghiên cứu của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ơng cho thấy tỷ lệ thất bại điều trị trong các nghiên cứu với phối hợp thuốc dihydroartemisinin - piperaquin khoảng < 5%. Với độ tin cậy là 95% (p = 0,05), độ chính xác d là 10% thì cỡ mẫu cho nghiên cứu loại này đợc tính theo bảng qui định cỡ mẫu năm 1987 dới đây.
Bảng 2.1. Tính cỡ mẫu theo quy định của WHO
Tỷ lệ quần thể (P) cho trước, mức độ tin cậy 95%
d 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50
0.05 73 138 196 246 288 323 350 369 380 384
0.10 18a 35a 49a 61 72 81 87 92 95 96
Nh vậy đối chiếu với bảng trên ta có cỡ mẫu là 18 bệnh nhân, cộng với 20% bệnh nhân có thể bị thất lạc là 4, ta có 22 bệnh nhân. Nhng đê mẫu có tính chất đại diện, số bệnh nhân nghiên cứu tại mỗi tỉnh sẽ bằng 50. Cỡ mẫu cho nghiên cứu này tại 2 tỉnh sẽ là ≥ 100 bệnh nhân.
Cỡ mẫu này cũng đồng thời sử dụng cho đánh giá kháng chloroquin bằng PCR. Nh vậy tổng số mẫu máu sẽ là ≥ 100 mẫu cho nghiên cứu phát hiện đột biến kháng CQ.
2.2.3.Thuốc và phác đồ dùng cho nghiên cứu
Thuốc Arterakin:
Viờn Arterakin chứa 40 mg dihydroartemisinin (DHA) và 320 mg piperaquin (PIP) do xớ nghiệp dược phẩm trung ương I sản xuất. Tất cả cỏc điểm sẽ cựng sử dụng 1 lụ do XNDP Trung uong 1 sản xuất, Số lô Botch.N0, ngày sản xuất 03/11/2008, hạn sử dụng tháng 11/2011 và được kiểm tra chất lượng tại Viện kiểm nghiệm Quốc gia.
Các thuốc khác dùng cho điều trị triệu chứng:
- Pracetamol dạng viên dùng khi trẻ dới 7 tuổi sốt > 3805 - Gói ORS,
Các thuốc dùng khi có biến chứng:
- Dịch truyền đẳng trơng (Glucoza 5%, Natriclorid 0,9%, Ringerlactat) trong trờng hợp xuất hiện những dấu hiệu biến chứng nặng.
- Thuốc artesunat dạng tiêm tĩnh mạch 60 mg/lọ (khi bệnh nhân nôn nhiều hoặc chuyển sang SRAT).
- Các thuốc chống dị ứng (khi có phát ban, mẩn ngứa).
Phác đồ điều trị:
Bảng 2.2. Liều Arterakin tính theo nhóm tuổi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Bộ Y Tế 2008)
Nhóm tuổi Số lượng viờn (Arterakin ) trong ng y™ à
0 giờ 8 giờ 24 giờ 48 giờ
2 - 3 tuổi 0.5 0.5 0.5 0.5
3 - < 8 tuổi 1.0 1.0 1.0 1.0
8 - < 15 tuổi 1.5 1.5 1.5 1.5
≥ 15 tuổi 2.0 2.0 2.0 2.0
Bảng 2.2 là phác đồ theo hớng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh sốt rét của Bộ y tế năm 2008 [3].
Tất cả liều thuốc được uống dưới sự giỏm sỏt của cỏn bộ cú chuyờn mụn. Quan sỏt bệnh nhõn trong 30 phỳt sau khi cho uống thuốc xem cú tỏc dụng phụ hoặc cú nụn khụng. Bệnh nhõn nào bị nụn trong thời gian này sẽ được uống lại thuốc với cựng liều và quan sỏt tiếp trong 30 phỳt nữa. Nếu bệnh nhõn lại nụn loại bệnh nhõn đú ra khỏi nghiờn cứu và cho điều trị bằng thuốc artesunat tiờm phối hợp doxycyclin (hoặc clindamycin) như hướng đẫn của Bộ Y tế.
2.2.4. Quy trình tiến hành nghiên cứu và theo dõi.
2.2.4.1. Quy trình đánh giá hiệu lực Arterakin trên lâm sàng
Nghiên cứu đợc tiến hành theo qui trình 28 ngày của Tổ chức y tế thế giới - WHO/MAL/96.1077 (Phụ lục 5).
Bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn sẽ đợc lập danh sách nghiên cứu. KST và nhiệt độ đợc theo dõi ngày 1 lần cho đến khi hết sốt và sạch KST trong 2 ngày liên tiếp. Ghi đầy đủ trong bệnh án các thông số theo dõi, các dấu hiệu lâm sàng, các chỉ số xét nghiệm và các triệu chứng phụ. Sau đó hàng tuần bệnh nhân đợc kiểm tra lại nhiệt độ, KSTSR vào các ngày D7,D14D,21D,28.
- Lam máu đựoc soi tìm KST. Đếm số lợng KST từ 2 ngời độc lập, sau đó đợc mã hoá theo địa điểm và ngày lấy lam máu từ D0 - D28
- Làm PCR mẫu máu ngày D0 để loại trừ đồng nhiễm P. vivax
- Nếu ngày D3 cha sạch ký sinh trùng phải lấy thêm mẫu máu vào các ngày D4 , D5…( chỉ dừng khi 2 ngày liên tiếp âm tính).
- Nếu có sốt lại trong bất kì ngày nào từ D7- D,28 thì ngời bệnh sẽ đợc khám và lấy máu tìm KST và làm PCR lại nh ngày D0.
- Nếu có KST sẽ đợc điều trị lại và lấy máu làm PCR để phân biệt tái phát, tái nhiễm theo qui trình.
Ngày D0 .
- Đo thân nhiệt (trên 37,50 C là sốt) - Cân nặng
- Lấy máu xét nghiệm : Tìm mật độ KSTSR (≥ 1000/mm3), làm PCR - Hỏi về tiền sử bệnh tật.
- Khám toàn thân loại trừ suy dinh dỡng, các bệnh cấp và mãn tính khác do vi khuẩn, vi rus.
- Thử nớc tiểu phát hiện thuốc SR trong nớc tiểu theo phơng pháp Dill - Glazco và Linin (Phụ lục 8).
- Thử nớc tiểu phát hiện có thai với phụ nữ từ 15 tuổi trở lên. - Ký cam kết tham gia một cách tự nguyện.
- Uống thuốc theo liều lợng, thời gian quy định.
Ngày D1
- Đo thân nhiệt.
- Khám, phát hiện, xử trí các tác dụng phụ nếu có. - Lấy máu làm xét nghiệm: Xác định mật độ KSTSR. - Cho uống thuốc theo phác đồ.
Ngày D2
- Đo thân nhiệt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Khám, xử trí cấc tác dung phụ.
- Lấy máu làm xét nghiệm: tìm mật độ KST. - Cho uống thuốc theo phác đồ.
Ngày D3
- Đo thân nhiệt.
- Khám, xử trí cấc tác dung phụ. - Lấy máu làm xét nghiệm tìm KST.
Ngày D4
- Đo thân nhiệt.
- Khám, xử trí cấc tác dung phụ. - Lấy máu làm xét nghiệm tìm KST.
Ngày D7,D14D,21D,28
- Đo thân nhiệt.
Bảng 2.3. Tóm tắt quy trình theo dõi từ D0 - D,2 Ngày D0 D1 D2 D3 D4 D7 D14 D21 D28 Ngày bất kỳ Khám lâm sàng X X X X X X X Đo nhiệt độ X X X X X X X Xét nghiệm KST X X X X X X X X X X Thử nớc tiểu X Làm bệnh án X Ký cam kết X Lấy mẫu PCR X X X Điều trị X X X X
Tác dụng phụ đợc định nghĩa là sự xuất hiện của bất kì một triệu chứng, dấu hiệu nào không có lợi, nằm ngoài các triệu chứng bệnh, làm tiến triển bệnh xấu đi sau khi sử dụng một thuốc trong thời gian nghiên cứu.
Bảng 2.4. Các tác dụng phụ không mong muốn và xử trí
Dấu hiệu phụ Ngày D0 - D28
Cần phải điêu trị triệu chứng Có ĐT Không ĐT Nhức đàu Mất ngủ Chóng mặt Buồn nôn Nôn Đau bụng Tiêu chảy Mẩn ngứa
2.2.4.2. Quy trình phân biệt tái phát, tái nhiễm bằng PCR
- Lấy máu đầu ngón tay vào giấy thấm Whatman 3MM ngày D0 và ngày sốt lại (từ D14-D28) cho nghiên cứu phân biệt tái phát, tái nhiễm.
- Giấy thấm đợc mã hoá theo mã của lam máu (theo ngày và địa điểm nghiên cứu).
- Bảo quản mỗi mẫu máu trong từng túi nilon riêng, chống ẩm, tránh ánh sáng, giữ ở nhiệt độ – 200 C.
- Xử lý mẫu máu bằng kĩ thuật PCR tại Khoa sinh học phân tử Viện SR - KST- CTTƯ dựa vào phân tích kiểu gen của P. falciprum trên 3 locus gen MSP1, MSP2, và GLURP. Nếu kiểu gen nhận biết ở 3 locus trên có biểu hiện giống hệt nhau là tái phát. Nếu khác nhau chỉ ở một trong ba locus gen trên là nhiễm mới [7], [9].
Các bớc tiến hành nh sau:
Phản ứng Nest 1:
• Đối với locus MSP1 sử dụng đôi mồi có trình tự sau:
M1-OF: 5'- CTA GAA GCT TTA GAA GAT GCA GTA TTG -3' M1-OR: 5'- CTT AAA TAG TAT TCT AAT TCA AGT GGA TCA-3' • Đối với locus MSP2 sử dụng đôi mồi:
M2-OF: 5'- ATG AGG GTA ATT AAA ACA TTA TCT ATT ATA -3' M2-OR: 5'- CTT TGT TAC CAT AGG TAC ATT CTT -3'
• Đối với locus GLURP sử dụng đôi mồi:
G-OF: 5'- TGA ATT TGA AGA TGT TCA CAC TGA AC -3' G-OR: 5'- GTG GAA TTG CTT TTT CTT CAA CAC TAA -3' Thành phần trong một ống phản ứng tổng thể tích 25 àl nh sau: dNTPs (2,0 mM) 2,5 àl
10x PCR buffer (20 mM MgCl2) 2,5 àl Mồi xuôi (1,25 àM) 1,0 àl Mồi ngợc (1,25 àM) 1,0 àl
Dịch chiết ADN 3,0 àl
Điều kiện tối u của phản ứng Nest1 là: Bớc 1 thực hiện 95ºC trong 5 phút, bớc 2 có 30 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 95ºC trong 5 phút, 58ºC trong 2 phút, 72ºC trong 2 phút, và 72ºC trong 8 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng Nest2:
Thành phần phản ứng Nest2 nh phản ứng Nest1, chỉ khác ADN khuôn đợc lấy từ sản phẩm Nest1.
• Đối với locus MSP1 sử dụng đôi mồi xác định các kiểu gen đặc hiệu theo K1, MAD20, RO33:
Đôi mồi xác định kiểu gen K1:
M1-2KF:5'- AAATGA AGA AGA AAT TAC TAC AAA AGG TGC -3' M1-2KR: 5'- GCT TGC ATC AGC TGG AGG GCT TGC ACC AGA -3'
Đôi mồi xác định kiểu gen MAD20:
M1-2MF:5'- AAATGA AGG AAC AAG TGG AAC GAC TGT TAC -3' M1-2MR: 5'- ATC TGA AGG ATT TGT ACG TCT TGA ATT ACC -3'
Đôi mồi xác định kiểu gen RO33:
M1-2RF: 5'- TAA AGG ATG GAG CAA ATA CTC AAG TTG TTG -3' M1-2RR: 5'- CAT CTG AAG GAT TTG CAG CAC CTG GCG ATC -3' • Đối với locus MSP2 dụng đôi mồi xác định kiểu gen đặc hiệu theo FC, IC
Đôi mồi xác định kiểu gen FC
M2-FCF : 5'- AAT ACT AAG AGT GTA GGT GCA AAT GCT CCA-3' M2-FCR : 5'- TTT TAT TTG GTG CAT TGC CAG AAC TTG AAC-3'
Đôi mồi xác định kiểu gen IC
M2-ICF : 5'- AGA AGT ATG GCA GAA AGT AAG CCT CCT ACT-3' M2-ICR : 5'- GAT TGT AAT TCG GGG GAT TCA GTT TGT TCG-3'
Điều kiện tối u của phản ứng: Bớc 1là 95ºC trong 5 phút, bớc 2 có 30 chu kỳ gồm 94ºC trong 1 phút, 61ºC trong 1 phút, 72ºC trong 2 phút, và 72ºC trong 8 phút.
• Đối với locus GLURP sử dụng đôi mồi xác định kiểu gen đặc hiệu là: G-FN: 5'- TGT TCA CAC TGA ACA ATT AGA TTT AGA TCA -3' G-OR: 5'- GTG GAA TTG CTT TTT CTT CAA CAC TAA -3'
Điều kiện tối u của phản ứng Nest2 : Bớc 1là 95ºC trong 5 phút, bớc 2 có 30 chu kỳ gồm 94ºC trong 1 phút, 58ºC trong 2 phút, 72ºC trong 2 phút, và 72ºC trong 8 phút. Thành phần của Nest2 chỉ khác Nest1 là ADN khuôn đợc lấy từ sản phẩm của Nest1.
Dựa vào phân tích kết quả kích thớc các alen trong 3 locus gen đa hình trên của KSTSR trớc khi điều trị và KSTSR xuất hiện lại sau khi điều trị để xác định tái phát hay nhiễm mới.
2.2.4.3. Quy trình xác định đột biến kháng thuốc của P. falciparum tại điểm 76 bằng kĩ thuật PCR
- Lấy máu ngay lúc sàng lọc của tất cả bệnh nhân đủ tiêu chuẩn nghiên cứu hiệu lực thuốc vào giấy thấm Whatman 3MM vào các ngày D0 cho nghiên cứu phát hiện kháng CQ.
- Mã của giấy thấm là mã đợc ghi trên lam kính tơng ứng của từng bệnh nhân trong nghiên cứu hiệu lực thuốc.
- Bảo quản mẫu máu trong từng túi nilon riêng, có chống ẩm, tránh ánh sáng ở nhiệt độ âm.
- Xử lý mẫu máu trên máy PCR tại Khoa sinh học phân tử, Viện SR - KST- CTTƯ.
Để phát hiện sự kháng CQ của P. falciparum cần xác định điểm đột biến 76Lys→76Thr bằng cách sử dụng kỹ thuật nested PCR với đôi mồi lồng ngoài có trình tự sau:
Phản ứng Nest1
TCRP1: 5’-CCG TTA ATA ATA AAT ACA CGC AG-3’ TCRP2: 5’-CGG ATG TTA CAA AAC TAT AGT ACC C-3’
Điều kiện tối u cho phản ứng Nest1 là 94˚C trong 3 phút, 45 chu kì tiếp theo gồm 94˚C- 30 giây, 57˚C- 30, 69˚C- 1 phút, cuối cùng là 70˚C- 8 phút. Sản phẩm của phản ứng Nest1: 573 bp (base pair-đôi bazơ)
Phản ứng Nest2:
• Xác định lysine tại điểm 76 bằng đôi mồi
76Com: 5’-CGA GCG TTA TAC AGA ATT AG -3’ 76W: 5’-tta aag ttc ttt tac caa aaa ttt-3’ • Xác định threonine tại điểm 76 bằng đôi mồi
76Com: 5’-cga gcg tta tac aga att ag-3’ 76M: 5’-tta aag ttc ttt tac caa aaa tgt-3’ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Điều kiện tối u của phản ứng Nest2 là 940C trong 3 phút, 30 chu kì tiếp theo ở 940C - 30 giây, 470C -10 giây, 600C -1 phút, và 600 C - 8 phút. Sản phẩm của phản ứng Nest2: 366 bp.
Dựa vào các dấu hiệu (markers) phân tử chuẩn hoặc các thang đo (ladders) chuẩn và phần mềm LabWorks 4.0 với hệ thống chụp ảnh kỹ thuật số Imaging Systems SDS - 8000 để tính kích thớc sản phẩm PCR thu đợc sau khi điện di.
Có nhiều kĩ thuật đợc sử dụng để đánh giá hiệu lực thuốc trong các nghiên cứu in vitro và in vivo [22], [34].
2.3.1 Kĩ thuật xét nghiệm tìm ký sinh trùng.
• Lấy lam máu:
Lấy máu đầu ngón tay làm lam máu giọt đặc và giọt đàn, nhuộm Giemsa soi kính hiển vi tìm KST. Lam máu giọt đặc chỉ đợc kết luận là âm tính khi soi đủ 100 vi trờng. Lam máu giọt đàn chỉ lấy vào ngày D0-D2 và ngày sốt lại
• Nhuộm giemsa:
Pha dung dịch Giemsa mẹ theo công thức Giemsa bột (aure B type): 3,8g Glycerol tinh khiết: 250ml Methyl alcohol, nguyên: 250ml Pha dung dịch đệm PBS có pH 7,2:
Potasium dihydrogen phophate (KH2PO4): 0,7g Disodium hydrogen photphate Na2HPO4: 1,0g
Nớc cất vừa đủ: 1.000ml
Pha dịch nhuộm mới 5%:
5ml dung dịch Giemsa mẹ cho vào 95ml dung dịch đệm Nhuộm lam máu:
Giọt máu đợc cố định bằng cồn methylic tuyệt đối trong 30 giây.
Nhỏ dung dịch nhuộm mới pha 5% lên lam máu đã cố định và giữ trong 30 phút.
Rửa lam kính đã nhuộm bằng nớc sạch và để khô.
Các lam dơng tính đợc xác định là P. falciparum đều đợc đếm ký sinh trùng thể vô tính so với bạch cầu theo tiêu chuẩn của WHO đếm ít nhất 200 hoặc 500 bạch cầu tuỳ theo số lợng KST trong máu nhiều hay ít.
Phát hiện, đếm KST dới vật kính dầu có độ phóng đại 100 Mật độ KST/mm3 đợc tính toán theo công thức nh sau:
Số KST đếm được x 8000 Mật độ KST/mm =
Số bạch cầu đếm được
2.3.2. Kĩ thuật phân biệt tái phát, tái nhiễm và xác định đột biến kháng chloroquin tại điểm 76 bằng PCR chloroquin tại điểm 76 bằng PCR
• Tách chiết ADN:
Kĩ thuật của Plowe và cs năm 1995, kĩ thuật này hay đợc sử dụng.
- Cắt mẫu máu bệnh nhân trên giấy thấm Whatman thành nhiều mảnh nhỏ rồi bỏ vào ống nhựa có dung tích 1,5ml
- Thêm vào ống chứa sinh phẩm 1ml hỗn dịch gồm Saponin 0,5% và PBS có pH 7,4.
- ủ ở nhiệt độ 37˚C trong 30ph. - Ly tâm tốc độ cao loại bỏ dịch nổi.
- Rửa 3 lần với 1ml/ lần dung dịch PBS ph 7,4.