Để kiểm tra phân đoạn nơi có sự hiện diện nhiều của 6xHis- betagalactosidase, phục vụ cho quá trình thu lượng lớn enzym chúng tôi thực hiện thí nghiệm này. Dòng E.coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ được nuôi cấy lắc 200rpm trong môi trường 2xYT qua đêm 370C có bổ sung ampicillin 100µg/ml. Hút 2ml dịch nuôi cấy này bỏ vào erlen chứa 200ml 2xYT có bổ sung ampicillin 100µg/ml, nuôi cấy trong điều kiện tương tự, sau 4 giờ nuôi cấy chúng tôi bổ sung IPTG 1mM và nuôi thêm 4 giờ trong cùng điều kiện, lấy 1ml dịch làm mẫu đối chứng dương và bảo quản 00C, phần còn lại tiến hành ly tâm thu sinh khối tế bào, lấy 1ml dịch nổi làm mẫu phân đoạn môi trương nuôi cấy. Sinh khối tế bào được đem phá vỡ thu protein theo như phần 2.4.10.3.
1 2 3 4 5 6 7 200kDa 116kDa 97kDa 66kDa 55kDa
Hình 3.17. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy 6xHis-betagalactosidase
hoạt tính biểu hiện ở dạng thể tan trong tế bào chất.
(Giếng 1, Thang chuẩn protein. 2, dịch nuôi cấy E.coli BL21(DE3) sau 8 giờ. 3, Dịch nuôi cấy E.coli BL21(DE3) có bổ sung IPTG. 4, Phân đoạn môi trường nuôi cấy sau ly tâm loại bỏ xác tế bào. 5, phân đoạn periplasmic. 6, Phân đoạn tế bào chất, thu protein dạng tan. 7, Phân đoạn tế bào chất, thu protein dạng thể vùi).
Trần Đức Thụy
Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy rằng, protein dung hợp 6xHis- betagalactosidase không có trong môi trường nuôi cấy và phân đoạn periplasmic. Hiện diện chủ yếu ở dạng tan trong tế bào chất. (Hình 3.17).
Như vậy chúng tôi xác định được enzym 6xhis-betagalactosidase được sinh ra ở tế bào chất dưới dạng thể tan khác với những đề tài sử dụng hệ plasmid pET trong biểu hiện thường cho protein dạng thể vùi. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc thu hồi protein và khẳng đinh tính định hướng của đề tài.
3.8. Thử khả năng thu hồi 6xHis-betagalactosidase với hạt Ni-NTA, dùng Imidazol ở tỷ lệ khác nhau.
Hạt Ni-NTA có ái lực với đuôi 6xHis trong enzym tái tổ hợp 6xHis- betagalactosidase. Dựa vào đặc tính này chúng tôi muốn thu lượng enzym sạch trong thể tan tế bào, phục vụ việc sản xuất sau này.
Hút dịch chứa hạt Ni-NTA vào eppendorf 1,5ml, rửa sạch hạt với đệm PBS 1x đảm bảo loại hết ethanol. Bỏ vào 3 eppendorf chứa hạt Ni-NTA dịch enzym, bổ sung imidazol theo tỷ lệ lần lượt như sau: 5,0mM; 7,5mM; 10mM ủ lắc 80rpm/40C 4 giờ. Sau thời gian ủ lắc như trên, chúng tôi tiến hành ly tâm nhẹ thu hạt và dịch nổi. Hạt được rửa sạch lại với đệm PBS1x đảm bảo loại hết dịch nổi còn thừa. Tiến hành điện di và quan sát vạch như phần 2.4.11.
Từ kết quả điện di chúng tôi rút ra những kết luận sau: hạt Ni-NTA có ái lực hoàn toàn với dạng đuôi His nên phần dịch nổi (giếng 1, 3, 5) không có vạch đặc trưng của 6xHis-betagalactosidase. Chúng tôi xác định được tại nồng độ 10mM imidazol thì khả năng thu 6xHis-betagalactosidase cao và nhất, kết quả điện di tại giếng 6 chúng tôi thu duy nhất enzym 6xHis-betagalactosidase, trong khi các giếng 2, 4 thì có nhiều vạch khác ngoài vạch 6xHis-betagalactosidase. (Hình 3.18).
Trần Đức Thụy
Như vậy chúng tôi đã thành công trong việc thu hồi enzym 6xHis- betagalactosidase và xác định được nồng độ imidazol cần thiết để thu được enzym dạng tinh nhất.
3.9. Xác định nhiệt độ, pH tối ƣu của enzym 6xHis-betagalactosidase 3.9.1. Xác định nhiệt độ tối ƣu 3.9.1. Xác định nhiệt độ tối ƣu
Mẫu được chuẩn bị: cho vào eppendorf lactose 7,5% pha trong đệm photphat- citrat pH 6,0 và thêm dịch enzym 6xHis-betagalactosidase thể tan thu được ở trên, cho phản ứng, bất hoạt phản ứng bằng Na2CO3. Tương tự làm với mẫu phản ứng ở nhiệt độ 450C, 500C, 550C, 600C và gửi qua Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano xác định lượng glucose sinh ra sau phản ứng (xem phụ lục 3).
Hình 3.18. Kết quả kiểm tra khả năng hạt Ni-NTA bám với 6xHis-
betagalactosidase. Tại nồng độ bổ sung 10mM imidazol thì khả năng thu hồi 6xHis-betagalactosidase là sạch nhất.
(Giếng 1, 3, 5: dịch nổi sau ly tâm lần lượt của 5mM; 7,5mM; 10mM imidazol. Giếng 2, 4, 6 hạt Ni-NTA sau rửa của 5mM; 7,5mM; 10mM imidazol).
Trần Đức Thụy
Đơn vị hoạt độ enzym 6xHis-beta-galactosidase được định nghĩa là số mol glucose phóng thích ra trong một phút (U/ml). Từ lượng glucose sinh ra chúng tôi xác định được đơn vị hoạt độ enzym 6xHis-beta-galactosidase như bảng 3.1.
nhiệt độ 0C mẫu 40 45 50 55 60 1 221,00 344,00 853,00 678,00 354,00 2 248,00 423,00 861,00 736,00 403,00 3 243,00 321,00 890,00 648,00 384,00 trung bình 237,33 362,67 868,00 687,33 380,33 sai số 14,36 53,50 19,47 44,74 24,70
Dựa vào kết quả trung bình đơn vị hoạt độ các mẫu 1, 2 và 3 chúng tôi vẽ đồ thị so sánh kết quả ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 40 45 50 55 60
Bảng 3.1. Kết quả xác định đơn vị hoạt độ beta-galactosidase (U/ml) trong thử
nghiệm thay đổi nhiệt độ
0
C
U/ml
Biểu đồ 3.1. Kết quả so sánh đơn vị hoạt độ ở nhiệt độ khác nhau
cho thấy tại nhiệt độ 500C enzym 6xHis- betagalactosidase có hoạt tính cao nhất.
Trần Đức Thụy
Từ kết quả biểu đồ 3.1 cho thấy, tại nhiệt độ 500C enzym beta-galactosidase có hoạt tính thủy phân cơ chất lactose cao nhất. Như vậy chúng tôi đã xác định được nhiệt độ tối ưu cho enzym.
3.9.2. Xác định pH tối ƣu
Tương tự từ lượng glucose sinh ra (xin xem phụ lục 3), chúng tôi tiến hành xác định điều kiện pH tối ưu.
Dựa vào kết quả trung bình đơn vị hoạt độ các mẫu 1, 2 và 3 chúng tôi vẽ đồ thị so sánh kết quả ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 3 4 5 6 7 pH mẫu 3 4 5 6 7 1 210.00 321.00 453.00 670.00 456.00 2 237.00 348.00 461.00 741.00 397.00 3 267.00 290.00 490.00 638.00 384.00 trung bình 238.00 319.67 468.00 683.00 412.33 sai số 28.51 29.02 19.47 52.72 38.37
Biểu đồ 3.2. Kết quả so sánh đơn vị hoạt độ ở điều kiện pH khác nhau. Tại
pH6,0 enzym 6xHis-betagalactosidase có hoạt tính cao nhất.
pH
U/ml
Trần Đức Thụy
Khi so sánh kết quả với một vài tác giả khác mà chúng tôi thu thập thì đơn vị hoạt độ enzym xác định cho 6xHis-betagalactosidase là ở mức trung bình (890U/ml). (Bảng 3.3)
Bảng 3.3. Kết quả so sánh đơn vị hoạt độ cao nhất β-galactosidase
3.10. Thử khả năng sinh GOS, phát hiện sản phẩm bằng sắc ký lỏng HPLC
Do enzym beta-galactosidase thủy phân lactose thành glucose, galactose , đồng thời nó còn có khả năng thực hiện phản ứng chuyển nhóm tạo hợp chất GOS nên chúng tôi thử khả năng tạo GOS với enzym tái tổ hợp 6xHis-betagalactosidase chúng tôi thu được. Kết quả được xác định qua sắc ký lỏng cao áp HPLC, tuy nhiên phương pháp HPLC chỉ cho biết các chất có thời gian lưu xác định biết trước nên chúng tôi sẽ phải sử dụng thêm phương pháp loại suy để kết luận.
Hoạt tính β-galactosidase cao nhất (U/mL) Nguồn Tác giả Tạp chí 14 Penicillium crysogenum Nagy et al Protein Expression Purification, 21 (2001), 24- 29
800 E.coli Martinez et al Enzyme Microb Technol, 22 (1998), 520-526. 890 E. coli Trình bày Trình bày
2050 L. acidophilus isolated from fermented ragi S K Akolkar, A D Sajgure and S S Lele Indian Journal of Biotechnology 5 (2006), 184-188 2319 E. coli: BL21(DE3) Synowiecki & Maciunska J Food Biochem, 26 (2002), 49-62
Trần Đức Thụy
Từ kết quả thu được cho thấy có điểm thời gian lưu của glucose 7,582; galactose 7,983 là hai sản phẩm được tạo ra sau phản ứng beta-galactosidase thủy phân lactose và thời gian lưu của lactose 6,817 là cơ chất chưa được phản ứng hết sau phản ứng (xem phụ lục 7), ngoài ra còn có thời gian lưu của những chất không biết rõ (2,623) và (5,489). Như vậy enzym 6xHis-betagalactosidase có khả năng thủy phân lactose tạo glucose, galactose đồng thời tạo ra những chất không rõ, có khả năng đây là các đoạn oligo-saccharide trong hỗn hợp GOS. (Hình 3.19).
Như vậy bước đầu chúng tôi đã xác định được 6xHis-betagalactosidase có khả năng thực hiện phản ứng chuyển nhóm tạo GOS từ đường lactose.
Hình 3.19. Kết quả chạy sắc ký lỏng HPLC cho thấy có sự tạo thành sản phẩm
glucose và galactose, đồng thời cũng có điểm thời gian lưu của chất lạ được cho là một trong những hỗn hợp của GOS
Trần Đức Thụy
Chƣơng 4
Trần Đức Thụy
4.1 Kết Luận
Từ các kết quả thu được trên đây chúng tôi rút ra một vài kết luận sau:
- Đã tổng hợp thành công gen mã hóa beta-galactosidase bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu.
- Chúng tôi đã tạo dòng thành công đoạn gen mã hóa beta-galactosidase dạng dung hợp vào vector pTrcHisB tạo vector pTrcHisB-LacZ và biến nạp thành công vector này vào chủng E.coli BL21(DE3) tạo dòng E.coli
BL21(DE3)/PtrcHisB-LacZ có khả năng biểu hiện beta-galactosidase ở dạng dung hợp 6xHis-betagalactosidase.
- Dòng E.coli BL21(DE3)/PtrcHisB-LacZ được thử khả năng sinh beta- galactosidase hoạt tính thủy phân X-Gal tạo màu.
- Đã thu nhận thành công 6xHis-betagalactosidase ở dạng thể tan từ dòng
E.coli BL21(DE3), có ý nghĩa quan trọng trong việc thu hồi sau này. - Xác định được nồng độ imidazol cần để thu 6xHis-betagalactosidase. - Thành công khả năng thủy phân lactose tạo GOS của enzym tái tổ hợp
6xHis-betagalactosidase.
- Xác định được điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu với 6xHis-betagalactosidase. - Bước đầu thành công trong việc thử khả năng tạo GOS từ enzym 6xHis-
betagalactosidase
4.2. Kiến nghị
- Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, điều kiện cảm ứng biểu hiện để đạt được hiệu suất biểu hiện protein dung hợp cao nhất.
- Thử khả năng lên men ở quy mô lớn hơn như 5 L, 20 L, 100 L - Xác định điều kiện chi tiết để thu được lượng cao GOS
- Mở rộng việc tạo dòng gen trong các hệ thống khác để khảo sát khả năng biểu hiện enzym 6xHis-betagalactosidase.
- Khảo sát tính chịu nhiệt của enzym 6xHis-betagalactosidase, gây đột biến điểm định hướng tại trung tâm phản ứng của enzym để tăng khả năng chịu nhiệt phục vụ sản xuất công nghiệp.
- Tăng cường độ lặp lại của thí nghiệm để có cơ sở vững chắc hơn nhằm ứng dụng để sản xuất enzym số lượng lớn phục vụ trong đời sống.
Trần Đức Thụy
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1] Hoàng Văn Quốc Chương (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất Insulin tái tổ hợp, Luận án Tiến Sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nghiên. [2] Lê Ngọc Hiếu (2010), Nghiên cứu sản xuất Miniproinsulin dung hợp với DsBA
tan trong chu chất Escherichia coli, Luận án Thạc Sỹ Sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nghiên.
Tiếng Anh
[3] Adam AC, Rubio-Texeira M, Polaina J (2004), “Lactose: the milk sugar from a biotechnological perspective”, Crit Rev Food Sci Nutr, 44(7-8), pp. 553-557. [4] Affertsholt-Allen T (2007), Market developments and industry challenges
forlactose and lactose derivatives, IDF Symposium “Lactose and itsDerivatives” Moscow. (http://lactose.ru/present/1Tage_Affertsholt- Allen.pdf.)
[5] Aronson M (1952), “Transgalactosidation during lactose hydrolysis”,
ArchBiochem Biophys, 39(2), pp. 370-378.
[6] Backhed F, Ley RE, Sonnenburg JL, Peterson DA, Gordon JI (2005), “Host- bacterial mutualism in the human intestine”, Science, 307(5717), pp. 1915- 1920.
[7] Bakker-Zierikzee AM, Alles MS, Knol J, Kok FJ, Tolboom JJM, Bindels JG. (2005), “Effects of infant formula containing a mixture of galacto- and fructo- oligosaccharides or viable Bifidobacterium animalis on the intestinal microflora during the first 4 months of life”. Br J Nutr, 94(5), pp 783-790. [8] Berger JL, Lee BH, Lacroix C (1997), “Purification, properties and
characterization of a high-molecular-mass beta-galactosidase isoenzym from Thermus aquaticus YT-1”, Biotechnol Appl Biochem, 25, pp. 29-41.
Trần Đức Thụy
[9] Boehm G, Stahl B, Jelinek J, Knol J, Miniello V, Moro GE (2005), “Prebiotic carbohydrates in human milk and formulas”, Acta Paediatr, 94, pp.18-21. [10] Brian W, Matthews, (2005), “The structure of E. coli β-galactosidase”,
Comptes Rendus Biologies, 328(6), pp. 549-556.
[11] Brosius J, Erfle M, and Storella J (1985), “Spacing of the -10 and -35 Regions in the tac Promoter”, J. Biol. Chem, 260, pp. 3539-3541.
[12] Burr G, Hume M, Neill WH, Gatlin DM (2008), “Effects of prebiotics on nutrient digestibility of a soybean-meal-based diet by red drum Sciaenopsocellatus”, Aquac Res, 39(15), pp. 1680-1686.
[13] Coutinho PM, Deleury E, Davies GJ, Henrissat B (2003), “An evolvinghierarchical family classification for glycosyltransferases”, J Mol Biol, 328(2), pp. 307-317.
[14] Cummings JH (1995), “Short chain fatty acids. In: Gibson GR, MacFarlane GT, editors. Human colonic bacteria: role in nutrition, physiology and health”,
CRC Press - Boca Raton - Fla, pp. 101-130.
[15] De Roode BM, Franssen ACR, van der Padt A, Boom RM (2003), “Perspectives for the industrial enzymatic production of glycosides”,
Biotechnol Prog, 19(5), pp. 1391-1402.
[16] Duarte P.M. Torres, Maria do Pilar F. Goncalves, José A. Teixeira, and Lígia R. Rodrigues (2010), “Galacto-Oligosaccharides: Production, Properties, Applications, and Significance as Prebiotics”, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 9, pp. 438-444.
[17] EFSA (2010a), “Consolidated list of Article 13 health claims List of references received by EFSA-Part 1”, European Food safety Authority. (http://www.efsa.europa.eu/en/ndaclaims13/docs/art13ref1.pdf.)
[18] EFSA (2010b), “Consolidated list of Article 13 health claims List of references received by EFSA-Part 3”, European Food safety Authority. (http://www.efsa.europa.eu/en/ndaclaims13/docs/art13ref3.pdf.)
Trần Đức Thụy
[19] Egon A, Brosius J, and Ptashne M (1983), “Vectors Bearing a Hybrid trp-lac Promoter Useful for Regulated Expression of Cloned Genes in Escherichia coli”, Gene, 25, pp. 167-178.
[20] European Directive (2008), “Commission Directive 2008/100/EC of 28 October 2008 amending Council Directive 90/496/EEC on nutrition labelling for foodstuffs as regards recommended daily allowances, energy conversion factors and definitions”. Official J Eur Union, L 285, pp. 9-12.
[21] Fanaro S, Chierici R, Guerrini P, Vigi V (2003), “Intestinal microflora in early infancy: composition and development”, Acta Paediatr, 92, pp. 48-55.
[22] Fox PF (2009), “Lactose: Chemistry and Properties. In: McSweeney PLH, Fox PF, editors. Lactose, water, salts and minor constituents. 3rd ed”, New York: Springer, pp. 1-15.
[23] Ganzle MG, Haase G, Jelen P (2008), “Lactose: crystallization, hydrolysis andvalue-added derivatives”, Int Dairy J, 18(7), pp. 685-94 .
[24] Gibson GR, Probert HM, Van Loo J, Rastall RA, Roberfroid MB (2004a), “Dietary modulation of the human colonic microbiota: updating the conceptof prebiotics”, Nutr Res Rev, 17(2), pp. 259-75.
[25] Gibson GR, Rabiu B, RycroftCE, RastallRA (2004b), “Trans- Galactooligosaccharides as prebiotics. In: Shortt C, O’Brien J, editors. Handbook of functional dairy products”, CRC Press-Boca Raton-Fla, pp. 91- 108.
[26] Gibson GR, Roberfroid MB, (1995), “Dietary modulation of the human colonic microbiota-introducing the concept of prebiotics”, J Nutr, 125(6), pp 1401-12.
[27] Gill SR, Pop M, DeBoy RT, Eckburg PB, Turnbaugh PJ, Samuel BS,Gordon JI, Relman DA, Fraser-Liggett CM, Nelson KE (2006), “Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome”, Science, 312(5778), pp.1355- 1359.
Trần Đức Thụy
[28] Gonzalez RR, Monsan P (1991), “Purification and some characteristics of beta-galactosidase from Aspergillus fonsecaeus”, Enz Microb Technol, 13, pp. 349-352.
[29] Harmsen HJM, Wildeboer-Veloo ACM, Raangs GC, Wagendorp AA, Klijn N, Bindels JG, Welling GW (2000), “Analysis of intestinal flora development in breast-fed and formula-fed infants by using molecular identification and detection methods”, J Pediatr Gastr Nutr, 30(1), pp. 61-67.
[30] Huber RE, Kurz G, Wallenfels K (1976), “Quantitation of factors which affect hydrolase and transgalactosylase activities of beta-galactosidase (Escherichiacoli) on lactose”, Biochemistry, 15(9), pp. 1994-2001.
[31] Krutmann J (2009), “Pre and probiotics for human skin”, J Dermatol Sci,
54(1), pp. 1-5.
[32] Kulp K (1975), “Carbohydrases”, Academic Press, pp. 92-97.
[33] Lifran EV, Hourigan JA, Sleigh RW (2009), “Lactose derivatives: turning waste into functional foods”, Aust J Dairy Technol, 64(1), pp. 89-93.
[34] Lind DL, Daniel RM, Cowan DA, Morgan HW (1989), “beta-Galactosidase from a strain of the anaerobic thermophile, Thermoanaerobacter”. Enz Microb Technol, 11, pp.180-186.
[35] Lupp C, Finlay BB (2005), “Intestinal microbiota”, Curr Biol, 15(7), pp. 235- 236.
[36] Macfarlane S, Macfarlane GT, Cummings JH (2006), “Review article: prebiotics in the gastrointestinal tract”, Aliment Pharmacol Ther, 24(5), pp. 701-714.
[37] Macfarlane GT, Steed H, Macfarlane S (2008), “Bacterial metabolism and health-related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics”, J Appl Microbiol, 104(2), pp. 305-344.
[38] Mwenya B, Santoso B, Sar C, Gamo Y, Kobayashi T, Arai I, Takahashi J (2004a), “Effects of including beta 1-4 galacto-oligosaccharides, lactic acid
Trần Đức Thụy
bacteria or yeast culture on methanogenesis as well as energy and nitrogen metabolism in sheep”. Anim Feed Sci Technol, 115(3-4), pp. 313-326.
[39] Mwenya B, Zhou X, Santoso B, Sar C, Gamo Y, Kobayashi T, Takahashi J (2004b), “Effects of probiotic-vitacogen and beta 1-4 galacto-oligosaccharides supplementation on methanogenesis and energy and nitrogen utilization in dairy cows”, Asian-Australas J Anim Sci, 17(3), pp. 349-354.
[40] Newburg DS (2000), “Oligosaccharides in human milk and bacterial colonization”, J Pediatr Gastr Nutr, 30, pp. 8-17.
[41] Ohtsu N, Motoshima H, Goto K, Tsukasaki F, Matsuzawa H (1998), “Thermostable beta-galactosidase from an extreme thermophile, Thermus sp. A4: Enzyme purification and characterization, and gene cloning and sequencing”. Biosci Biotechnol Biochem, 62, pp. 1539-1545.
[42] Paige DM (2005), “Lactose intolerance. In: Caballero B, Allen L, Prentice A,editors. Encyclopedia of human nutrition. 2nd ed”, Oxford: Elsevier Ltd, pp. 113-120.
[43] Petzelbauer I, Reiter A, Splechtna B, Kosma P, Nidetzky B (2000a), “Transgalactosylation by thermostable beta-glycosidases from Pyrococcus furiosus and Sulfolobus solfataricus-binding interactions of nucleophiles with the galactosylated enzyme intermediate make major contributions to theformation of new beta-glycosides during lactose conversion”, Eur J Biochem, 267(16), pp. 5055-5066.
[44] Playne MJ, Crittenden RG (2009), “Galacto-oligosaccharides and other products derived from lactose. In: McSweeney PLH, Fox PF, editors. Lactose, water, salts and minor constituents. 3rd ed”, New York: Springer, pp. 121-201.