SDS-PAGE
Mẫu điện di được chuẩn bị bằng cách huyền phù lượng sinh khối tế bào thu từ 1ml dịch nuôi cấy trên trong 100µl đệm PBS 1X để đạt nồng độ 10X. Hút 20µl dịch huyền phù vào eppendorf, bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng.,điện di SDS-PAGE 100v kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosidase với thang protein chuẩn.
2.4.12.3. Kiểm tra phân đoạn chứa 6xHis-betagalactosidase
Phân đoạn môi trường nuôi cấy
Hút 1000µl dịch nổi thu bước 2.4.12.1 vào eppendorf, tủa thu protein (nếu có) bằng cách 100µl TCA 100% vortex 15s và đặt eppendorf trên đá bào 15 phút, ly tâm lạnh 13000 rpm/15 phút và đổ bỏ phần dịch. Phần cặn thu được rửa hai lần với acetone bằng cách thêm 100µl acetone, búng nhẹ vào thành eppendorf và ly tâm lạnh 13000rpm/5 phút đổ phần dịch. Ủ khô phần cặn ở nhiệt độ phòng 1 giờ và huyền phù trong 100µl đệm PBS1X.
Dịch điện di được chuẩn bị bằng cách hút 20µl dịch protein bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng và điện di 100V kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosidase với thang protein chuẩn.
Phân đoạn periplasmic trong tế bào E.coli BL21(DE3)-LacZ
Huyền phù lượng sinh khối tế bào thu được từ ly tâm 3ml dịch nuôi cấy bước 2.4.12.1 trong 3ml đệm (30 mM Tris-HCl, 20% sucrose, pH 8,0), thêm 6 µl 0.5M EDTA, pH 8 đạt nồng độ 1mM. Lắc nhẹ 10 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm lạnh
Trần Đức Thụy
40C 10,000 rpm/10 phút thu phần cặn. Huyền phù phần cặn trong 3ml MgSO45mM làm lạnh sẵn, lắc nhẹ trên đá bào 10 phút để những protein periplasmic phóng thích vào trong dịch. Ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút để lắng cặn, hút phần dịch nổi tiến hành điện di SDS-PAGE. Phần cặn bảo quản 00C làm các bước tiếp theo.
Dịch điện di được chuẩn bị bằng cách hút 20µl dịch protein bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng. Điện di 100V kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosidase với thang protein chuẩn.
Phân đoạn thể tan trong tế bào chất (soluble cytoplasmic fraction)
Rửa sạch phần cặn thu trong bước lấy phân vung periplasmic với 1ml PBS 1X ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút. Huyền phù trong 300µl đệm STE 1X làm lạnh sẵn, ly giải tế bào với 30µl lysozym 10mg/ml, ủ trên đá bào 15 phút, phá màng tế bào trong sóng siêu âm 10 phút. Ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút thu phần dịch nổi chứa protein 6xHis-betagalactosidase (nếu có), bổ sung triton-x100 đạt nồng độ cuối 1%. Phần cặn sau ly tâm được bảo quản 00C chờ làm bước tiếp theo.
Dịch điện di được chuẩn bị bằng cách hút 20µl dịch protein bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng. Điện di 100v kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosidase với thang protein chuẩn.
Phân đoạn thể vùi trong tế bào chất (insoluble cytoplasmic fraction)
Phần cặn thu sau ly tâm thu bước trên được rửa sạch ba lần với 1ml PBS 1X ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút. Huyền phù trong 300µl đệm STE 1X làm lạnh sẵn, bổ sung 0,5% 2-mercaptoethanol và 0,5% sarkosyl (stock 20%), phá màng thể vùi trong sóng siêu âm 10 phút. Ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút thu phần dịch nổi chứa protein 6xHis-betagalactosidase nếu có, bổ sung triton-x100 đạt nồng độ cuối 1%.
Trần Đức Thụy
Dịch điện di được chuẩn bị bằng cách hút 20µl dịch protein bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng. Điện di 100v kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosdiase với thang protein chuẩn.
2.4.13. Thử khả năng thu hồi 6xHis- betagalactosidase với hạt Ni-NTA, dùng Imidazol ở tỷ lệ khác nhau Imidazol ở tỷ lệ khác nhau
Hút 60µl dịch chứa hạt Ni-NTA vào eppendorf 1,5ml, rửa sạch hạt bằng cách cho 1ml PBS 1x làm lạnh sẵn vào, lộn ngược eppendorf vài lần, spin nhẹ thu hạt và đổ dịch nổi. Hạt được rửa 5 lần như trên đảm bảo loại hết ethanol. Bỏ vào 1ml dịch enzym, ủ lắc 80rpm/4 giờ nhiệt độ 250C. Do hạt niken có ái lực với đuôi 6xHis của enzym tái tổ hợp 6xHis-beta-galactosidase nên chúng tôi có thể thu được enzym. Tuy nhiên để tăng tính đặc hiệu trong thu hồi enzym, chúng tôi cũng bổ sung imidazol ở các nồng độ khác nhau như 5,0mM; 7,5mM và 10mM imidazol. Sau thời gian ủ lắc, chúng tôi tiến hành ly tâm nhẹ thu hạt và dịch nổi, hạt này sẽ được rửa 3 lần với đệm PBS1x (tương tự trên) để loại bỏ hết dịch nổi (dịch này có thể còn lượng enzym dư cần thu hồi chưa tạo liên kết với hạt Ni-NTA).
Tiến hành điện di SDS-PAGE bằng cách sau: với mẫu 5mM imidazol, hút 20µl dịch nổi vào eppendorf 1,5ml và 20µl hạt Ni-NTA vào eppendorf 1,5ml khác, lần lượt bỏ vào mỗi eppendorf 5µl dịch nạp mẫu, đun cách thủy 5 phút và nạp 20µl dịch mẫu này vào giếng. Làm tương tự với mẫu 7,5mM; 10mM imidazol. Chạy điện di 100V/ 2 đến 3 giờ. Gel sau khi chay điện di được nhuộm với coomassive blue và giải nhuộm. Quan sát trên đèn phát ánh sáng huỳnh quang để xem rõ vạch điện di.
2.4.14. Xác định nhiệt độ, pH tối ƣu cho enzym 6x-betagalactosidase
Sau khi thu hồi enzym từ phân đoạn thể tan trong tế bào chất, dịch enzym được đem xác định đơn vị hoạt độ. Cho vào eppendorf 700µl lactose 7,5% pha trong đệm photphat pH 6,0 và thêm vào 50µl dịch enzym thể tan thu được ở trên,
Trần Đức Thụy
cho phản ứng trong điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau trong 30 phút, bất hoạt phản ứng bằng 40µl Na2CO3. Mẫu được bảo quản nhiệt độ đông đá và gửi xác định hàm lượng glucose phóng thích ra trên hệ Autolab (Phòng Thí Nghiệm công nghệ Nano).
Từ hàm lượng glucose phóng thích chúng tôi xác định được đơn vị hoạt độ enzym. Đơn vị hoạt độ được định nghĩa là số mol glucose sinh ra trong 1 phút bằng công thức U = X.V/T.v, trong đó U đơn vị hoạt độ; X là số mol glucose sinh ra; V(ml) thể tích enzym và cơ chất; v(ml) thể tích enzym cho phản ứng; T(phút) thời gian phản ứng .
Mỗi mẫu đo 3 lần, chúng tôi xác định được đơn vị hoạt độ trung bình và đem so sánh kết quả trên đồ thị.
2.4.15. Thử khả năng sinh GOS từ enzym beta-galactosidase, đánh giá kết quả bằng sắc ký lỏng HPLC.
Chuẩn bị các mẫu như sau: gồm mẫu phản ứng 1 và các mẫu đối chứng 2, 3, 4 phục vụ cho máy đọc. Kết quả đọc tại máy HPLC của đại học Bách Khoa Tp.HCM.
Mẫu 1: lactose 7,5% pha trong đệm photphat-citrat pH 6,0 và lấy 500 µl dịch này bỏ vào eppendorf, bổ sung thêm 250 µl dịch enzym beta-glactosidase (thu được ở phần tách phân đoạn). Cho phản ứng ở pH 6,0 và nhiệt độ 500C 12 giờ, bất hoạt phản ứng bằng 40 µl Na2CO3bảo quản nhiệt đông đá và gửi đọc kết quả trên máy HPLC trường đại học Bách Khoa Tp.HCM.
Mẫu 2: làm tương tự mẫu 1 nhưng bất hoạt phản ứng ngay, không cho phản ứng xảy ra.
Mẫu 3: tương tự mẫu 1 nhưng thay lượng lactose bằng đệm. Mẫu 4: tương tự mẫu 1 nhưng thay thể tích enzym bằng đệm.
Khi có phản ứng beta-galactosidase thủy phân lactose tại điều kiện nhiệt độ 500C và pH6,0 sẽ tạo thành sản phẩm và được đọc kết quả trên hệ thống HPLC.
Trần Đức Thụy
Chƣơng 3
Trần Đức Thụy
3.1. Tạo dòng gen LacZ trong plasmid pCR-XL-TOPO® vào tế bào E.coli
Match1TM-T1R.
3.1.1. Tổng hợp gen LacZ mã hóa beta-galactosidase
Đoạn gen LacZ được tổng hợp từ plasmid pAc5.1/V5-HisB/LacZ bằng phương pháp PCR với cặp mồi F-XhoI-BetaGal/ R-HindIII-BetaGal và sử dụng enzym Pfu DNA polymerase. Sản phẩm PCR có kích thước dự đoán 3071 bp được phân tích trên gel agarose 0,8%.
Kết quả thu được trên hình cho thấy vạch điện di rõ ràng, sản phẩm này có kích thước 3071bp. (Hình 3.1).
Hình 3.1. Kết quả phản ứng PCR phát hiện gen LacZ được khuếch đại từ plasmid pAc5.1/V5-HisB-LacZ điện di trên gel agarose 0,8%. (giếng 1:thang DNA; giếng 2: gen LacZ kích thước 3071bp)
1 2
3000b p
3071b p
Trần Đức Thụy
3.1.2. Tạo dòng gen LacZ vào plasmid pCR-XL-TOPO®.
Gen LacZ sau khi được tổng hợp, nhờ đặc tính men Taq polymerase nên luôn luôn được thêm nucleotide A ở đầu tận 3’ do vậy nên đoạn LacZ dễ dàng được chèn vào plasmid pCR-XL-TOPO® đã được duỗi thẳng với hai đầu lệch 5’có nucleotide T. Trên plasmid TOPO này, men topoisomerase I được nối đồng hóa trị trên trình tự tận CCCTT của plasmid, và chính nhờ vậy nên một khi đoạn LacZ được chèn vào, phản ứng nối sẽ lập tức xảy ra và năng lượng cho phản ứng nối được cung cấp từ sự bẻ gãy cầu nối phosphodiester giữa phospho với gốc tyrosyl của men topoisomerase I.
Thực hiện điện biến nạp plasmid pCR®
-XL-TOPO®/LacZ này vào vi khuẩn
E.coli Match1TM-T1R. Chọn lọc các dòng tế bào đã biến nạp plasmid tái tổ hợp bằng cách trải các tế bào vi khuẩn này trên môi trường LB-agar có bổ sung kanamycin.
Kết quả sau 14 giờ chúng tôi đã thu được các khuẩn lạc màu trắng của thể biến nạp E.coli Match1TM-T1R có mang plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ kháng
Hình 3.2. Đĩa thạch LB-Kanamycin với các khuẩn lạc E.coli Match1TM-T1R chứa plasmid tái tổ hợp pCR-XL-TOPO®/LacZ sau nuôi cấy 14 giờ.
Trần Đức Thụy
kanamycin, những khuẩn lạc mang plasmid không có gen LacZ sẽ bị chết do trên plasmid này chứa trình tự gen gây chết. (Hình 3.2).
Chọn ngẫu nhiên 10 khuẩn lạc cấy tăng sinh chọn lọc trong LB/ kanamycin. Kết quả sau 14 giờ nuôi cấy ống nghiệm 2, 3, 6, 7, 8, 9 và 10 có môi trường đục, khẳng định kết quả biến nạp thành công plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ vào tế bào
E.coli Match1TM-T1R. (Hình 3.3).
Hình 3.3. Kết quả tăng sinh chọn lọc 10 dòng E.coli Match1TMT1R mang plasmid tái tổ hợp plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ trong LB- Kanamycin.
(Ống nghiêm 1,4,5 không chuyển đục trong khi 7 ống nghiệm còn lại 2,3,6,7,8,9 chuyển đục sau nuôi cấy lắc 370C/14 giờ do chứa plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ có gen kháng kanamycin)
Trần Đức Thụy
3.2. Kiểm tra dòng E.coli Match1TM-T1R mang plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ TOPO®/LacZ
3.2.1. Dùng phƣơng pháp cắt hạn chế kiểm tra dòng E.coli Match1TM-T1Rmang Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ, thu gen LacZ mang Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ, thu gen LacZ
Để kiểm tra kết quả tạo dòng chúng tôi chọn ống nghiệm số 6 phía trên tiến hành PCR khuẩn lạc cho kết quả dương tính nên chúng tôi đi ly tâm thu sinh khối và trích biệt plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ. Tiến hành cắt plasmid này bằng phương pháp cắt giới hạn, đồng thời thu nhận gen LacZ.
Dòng plasmid trích biệt được thực hiện phản ứng cắt giới hạn đồng thời với hai enzym XhoI và HindIII, điện di trên gel agarose-ethidum bromide 0,8% cho hai vạch rõ ràng là 3,5kb tương ứng với plasmid pCR®-XL-TOPO® dạng mở vòng và vạch khoảng 3,1kb tương ứng với gen LacZ (giếng 1 và 2 hình 3.4). Như vậy chúng tôi đã tạo dòng thành công gen LacZ vào plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ.
Hình 3.4. Kết quả cắt plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ với XhoI và HindIII cho hai vạch kích thước 3,1kb và 3,5kb (giếng 2).
(Giếng 1, đối chứng (+) gen LacZ; 2, Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ cắt bằng XhoI và Hind III; 3, Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ trích biệt từ ống nghiệm số 6; 4, Thang chuẩn DNA 500bp)
LacZ 7,0k b 3,0k b 3,5k b
Trần Đức Thụy
Plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ được cắt với XhoI và HindIII cho hai vạch rõ ràng nên chúng tôi tiến hành điện di và cắt thu băng LacZ trên gel agarose crystal violet 0,8%, tinh sạch bằng bộ kit tinh sạch “TOPO® XL Gel Purification Kit” của Invitrogen, điện di ước lượng hàm lượng DNA thu được, bảo quản 00C làm nguyên liệu cho bước tiếp theo.
3.2.2. Giải trình tự so sánh trình gen LacZ thu đƣợc với gen LacZ trên plasmid pAc5.1/V5-HisB/LacZ. pAc5.1/V5-HisB/LacZ.
Để khẳng định lại kết quả tạo dòng gen LacZ vào plasmid pCR-XL-TOPO® chính xác, chúng tôi gửi mẫu plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ đi giải trình tự, plasmid được giải trên hai mạch. Kết quả giải trình tự với mồi xuôi F-XhoI-BetaGal được trình bày ở hình 3.5 và kết kết quả giải trình tự với mồi ngược R-HindIII- BetaGal được trình bày ở hình 3.7.
Hai kết quả giải trình tự từ hai đầu 5’ đến 3’ trên hai mạch đoạn gen LacZ cho kết quả rõ, được chúng tôi dùng phần mềm jellyfish để kiểm tra trình tự gen LacZ được tạo dòng đúng với trình tự thiết kế. Kết quả khẳng định gen LacZ được tạo dòng có độ độ tương đồng lớn hơn 95% so với trình tự trên plasmid pAc5.1/v5HisB/LacZ. (Hình 3.6 và 3.8).
Trần Đức Thụy Hình 3.5 . Kết qu ả giải trình tự đo ạn gen LacZ trong pla smid p CR -XL -TOPO®/ LacZ vớ i mồi F -XhoI -Bet aGal
Trần Đức Thụy
Hình 3.6. Kết quả so sánh độ tương đồng trình tự LacZ được
tạo dòng trong plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ (giải trình tự bằng mồi xuôi F-XhoI-betaGal) với trình tự LacZ trên plasmid pAc5.1/v5HisB-LacZ)
Trần Đức Thụy Hình 3.7. Kết qu ả giải trình tự đo ạn gen LacZ trong pla smid p CR -XL -TOPO®/ LacZ vớ i mồi ngượ c R -Hind III -Beta G al
Trần Đức Thụy
Hình 3.8 Kết quả so sánh độ tương đồng trình tự LacZ được tạo dòng trong plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ (giải trình tự bằng mồi ngược R-HindIII-betaGal) với trình tự LacZ trên plasmid pAc5.1/v5HisB-LacZ
Trần Đức Thụy
3.3. Tạo dòng gen LacZ vào plasmid pTrcHisB trong tế bào E.coli DH5α
Gen LacZ thu được sẽ được nối vào plasmid pTrcHisB bằng enzym ligase, gọi là pTrcHisB-LacZ.
Thực hiện điện biến nạp sản phẩm nối trên vào vi khuẩn E.coli DH5α. Chọn lọc các tế bào đã biến nạp plasmid bằng cách trải các tế bào vi khuẩn này trên môi trường LB-agar có bổ sung ampicillin chúng tôi đã thu được các khuẩn lạc màu trắng của thể biến nạp E.coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ có khả năng kháng ampicillin (Hình 3.9). Các khuẩn lạc này được chọn làm các dòng dự tuyển cho các bước chọn lọc tiếp theo.
Chọn vài khuẩn lạc mọc trên LB-ampicillin tiến hành PCR khuẩn lạc và cấy sao chép đồng thời qua đĩa thạch LB-Ampicillin khác. Chạy điện di kiểm tra các dòng có khuếch đại gen LacZ, với 6 khuẩn lạc cho PCR dương tính chúng tôi tiến hành nuôi tăng sinh chọn lọc trong ống LB bổ sung ampicillin và ly tâm thu sinh khối tế bào và trích biệt plasmid.
Plasmid thu được thu nhận bằng kit “AccuPrep® Plasmid mini Extraction kit” của Bioneer. Và chạy điện di trên gel agarose 0,8% kiểm tra kích thước plasmid thu được.
Hình 3.9. Kết quả điện biến nạp, khuẩn lạc pTrcHisB-LacZ
mang gene kháng ampicillin mọc trên LB-Amp sau 14 giờ nuôi cấy
Trần Đức Thụy
Kết quả điện di cho thấy vạch rõ ràng, như vậy chúng tôi thu được 6 dòng plasmid pTrcHisB-LacZ có kích thước khoảng 7,5kb. (Hình 3.10).
Chọn dòng số 4 và tiến hành kiểm tra plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ bằng cắt giới hạn, sử dụng enzym cắt giới hạn XhoI và HindIII. Chạy điện di trên gel agarose 0,8% cho thấy kết quả có hai vạch có kích thước khoảng 3,1kb tương ứng với gen LacZ (giếng 1 và 2) và vạch có kích thước 4,4kb tương ứng với plasmid pTrcHisB ở dạng thẳng. (Hình 3.11). Như vậy có sự hiện diện gen LacZ trong plasmid pTrcHisB/LacZ
7,5k b 2,0k b
Hình 3.10. Kết quả trích biệt thu 6 dòng
plasmid pTrcHisB-LacZ
(giếng 1 thang chuẩn DNA 500bp; giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7 plasmid pTrcHisB-LacZ).
Trần Đức Thụy
Như vậy chúng tôi đã thành công tạo dòng E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ. Plasmid pTrcHisB-LacZ được giải trình tự với cặp mồi F- XhoI-BetaGal để phân tích trình tự gen và độ đồng khung.
Do việc giải trình tự được dùng với mồi xuôi F-XhoI-BetaGal nên phần kết quả những nucleotide đầu không thấy, tuy nhiên dựa vào những nucleotide thấy được từ mồi chúng tôi khẳng định gen LacZ có độ đồng khung 100% so với trình tự gốc trên plasmid pAc5.1/V5-HisB/LacZ. (Hình 3.12).
LacZ
2,0kb
4,0kb 3,0kb