Sau khi nuôi cấy, trên bề mặt đĩa xuất hiện các khuẩn lạc có khả năng kháng ampicillin. Tiến hành đánh dấu các khuẩn lạc và thực hiện:
Kiểm tra dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR.
Chuẩn bị các thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc trong eppendorf như sau
DW 14,75 µl
Mẫu khuẩn lạc 0µl
Taq DNA polymerase buffer 10X(-MgCl2) 2,5 µl
MgCl2 (50mM) 1,25µl
F-XhoI-BetaGal (10µM) 2µl
R-HindIII-BetaGal (10µM) 2µl
dNTP (2.5mM) 2µl
Taq DNA polymerase 0,5µl
Tổng thể tích 25µl
Chọn vài khuẩn lạc đã đánh dấu, dùng tăm vô trùng cấy tương ứng qua đĩa LB-agar-ampicillin đồng thời phần còn lại của khuẩn lạc cho vào eppendorf đã chuẩn bị ở trên. Đặt eppendorf vào máy luân nhiệt tiến hành chạy theo chương trình như phần 2.4.6.1.
Tiến hành chạy điện di trên gel agarose 0,8%/ethidium bromide để kiểm tra sản phẩm PCR.
Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ bằng enzym cắt giới hạn
Từ kết quả PCR chúng tôi xác định được những khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ, để khẳng định lại kết quả chúng tôi tiến hành cắt
Trần Đức Thụy
plasmid tái tổ hợp này bằng 2 enzym cắt hạn chế XhoI và HindIII. Đầu tiên lấy ống nghiệm chứa 5ml LB, bổ sung 5µl kháng sinh ampicillin 1000x để đạt nồng độ cuối là 100µg/ml. Lấy khuẩn lạc PCR dương tính cấy vào ống nghiệm, nuôi ở 370C 2000rpm/phút 12-16 giờ. Thu tế bào và trích biệt plasmid bằng bộ kit
“AccuPrep® Plasmid mini Extraction kit” của Bioneer như mục 2.4.4.
Kiểm tra plasmid trích biệt bằng enzym cắt giới hạn XhoI và HindIII theo thành phần phản ứng sau: DW 14µl Buffer 3µl XhoI 1,5µl HindIII 1,5µl pTrcHisB-LacZ 10µl tổng cộng 30µl
Ủ hỗn hợp ở 370C/1h, chạy điện di trên gel agarose 0,8% cho hai vạch là 4,4 kb tương ứng với plasmid pTrcHisB dạng mở vòng và vạch 3071bp tương ứng với gen LacZ.
Kiểm tra độ đồng khung plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ bằng phương pháp giải trình tự
Plasmid pTrcHisB-LacZ đã qua sàng lọc trên được đem tăng sinh và trích biệt plasmid, đem giải trình tự bằng cặp mồi F-XhoI-BetaGal. Trình tự thu được sẽ đem phân tích và so sánh độ tương đồng với trình tự LacZ trong plasmid pAc5.1/V5-HisB/LacZ bằng phần mêm jellyfish 3.31.
Trần Đức Thụy