Khuẩn lạc đơn E.coli DH5α được cấy trong ống nghiệm chứa 5ml LB lỏng, nuôi 370C/200rpm. Sau 18-24h hút dịch lỏng chuyển qua erlen chứa 200ml LB lỏng, chú ý thao tác trên đèn cồn để tránh nhiễm, nuôi 370C/200rpm 12h.
Chia 50ml dịch nuôi cấy này vào ống falcon đã làm lạnh trên đá bào, ly tâm 2000rpm/10 phút 40C đổ dịch nổi thu tế bào. Huyền phù lượng tế bào trong 15ml dung dịch RF1 đã làm lạnh sẵn, đặt trên đá lạnh 30 phút.
Ly tâm 2000rpm/10 phút 40C đổ dịch nổi, huyền phù lượng tế bào thu được trong 4ml dung dịch RF2, đặt trên đá lạnh ít nhất 20 phút. Phân đều lượng 100µl tế bào khả nạp vào mỗi eppendorf 1,5ml bảo quản -800C chờ sử dụng.
2.4.4. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận plasmid
Phương pháp được thực hiện dựa trên nguyên tắc dùng dung dịch kiềm để ly giải vi khuẩn E.coli phóng thích ra DNA, sau đó ly tâm lấy dịch nổi chứa plasmid DNA. Plasmid DNA sẽ bị tóm bắt khi đi qua màng silica của cột và cuối cùng dùng nước thôi ra khỏi cột để được thu nhận trong dung dịch. Để đơn giản và hiệu quả trong tách biệt plasmid DNA chúng tôi giới thiệu ra đây phương pháp dùng kit
“AccuPrep® Plasmid mini Extraction kit”của Bioneer như sau.
- Cho toàn bộ 5ml dịch cấy vi khuẩn E. coli vào tube falcon 15ml. Vặn chặt nắp. Ly tâm tốc độ tối đa trong 10 phút. Đổ bỏ kiệt phần nước nổi. Cho vào cắn vi khuẩn 250µl dung dịch Cell Resuspension Solution rồi vortex để hòa tan cắn vi khuẩn. Hút toàn bộ dịch vi khuẩn này sang một tube Eppendorf tinh sạch.
- Cho vào tube chứa dịch vi khuẩn 250µl dung dịch Cell Lysis Solution. Đậy nắp tube và úp ngữa 4 lần để trộn đều (tránh vortex). Để yên trong nhiệt độ phòng cho đến khi dịch tế bào vừa kịp trong đi (trong vòng 1 đến 5 phút)
- Thêm vào dịch vi khuẩn 350µl dung dịch trung hòa (Neutralization Solution). Đậy nắp tube và úp ngữa 4 lần để trộn đều (tránh vortex)
Trần Đức Thụy
- Ly tâm 13000rpm trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Dùng micropipette 1000µl để hút khoảng 850µl dịch nổi cho vào cột đã được đặt trong một tube thu nhận (collection tube). Tránh hút nhằm phần cặn.
- Ly tâm cột trong tube thu nhận 13000rpm /1 phút. Lấy cột khỏi tube thu nhận và đổ bỏ nước trong tube thu nhận. Cho cột vào trở lại tube thu nhận.
- Cho 700µl dịch rửa màng (Membrane Wash Solution). Ly tâm 13000rpm trong 1 phút để rửa cột. Đổ bỏ dịch rửa màng thu được trong tube thu nhận. Đặt cột trở lại vào trong tube thu nhận. Rửa lại cột một lần nữa với 250µl dịch rửa màng bằng ly tâm 13000rpm trong 2 phút.
- Lấy cột khỏi tube thu nhận. Cẩn thận tránh đáy cột bị ướt với dịch rửa màng thu trong tube thu nhận. Đổ bỏ dịch rửa màng khỏi tube thu nhận. Đặt cột trở lại tube thu nhận rồi ly tâm 13000rpm thêm một phút nữa với nắp máy ly tâm mở (không đóng) để mau làm khô ethanol thừa khỏi cột.
- Cẩn thận lấy cột khỏi tube thu nhận và đặt cột vào một tube Eppendorf 1.5ml tinh sạch. Cho vào cột 40µl nước tinh sạch nuclease (nuclease-free water). Ly tâm 13000rpm trong 1 phút để thu dịch plasmid DNA khỏi cột vào tube Eppendorf.
- Bỏ cột đi. Đậy chặt tube chứa dịch DNA và giữ tube ở –20oC cho đến khi sử dụng.
2.4.5. Phƣơng pháp điện di DNA2.4.5.1. Nguyên tắc 2.4.5.1. Nguyên tắc
DNA sẽ đi từ cực âm sang cực dương, trọng lượng phân tử DNA nhẹ sẽ di chuyển xuống trước, nặng di chuyển chậm sẽ xuống sau, tạo thành dãy DNA có kích thước phân tử khác nhau
Trần Đức Thụy
2.4.5.2. Phƣơng pháp
Chuẩn bị bồn điện di bằng cách đổ dung dịch TAE 1X cho đến vạch định mức của bồn điện di.
Chuẩn bị bản gel Agarose 0,8% bằng cách trộn 0,8g Agarose vào bình tam giác 250ml, bổ sung TAE 1X để được 100ml dung dịch. Nấu gel trong lò vi sóng khoảng từ 2 phút, thỉnh thoảng quan sát và lắc mạnh bình cho đến khi gel tan hoàn toàn. Để gel nguội đến 65oC, sau đó cho vào thạch 2µl Ethidium Bromide 10mg/ml, trộn đều tránh làm thạch có bọt khí. Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, đổ gel vào khuôn cho đạt được bề dày mong muốn (khoảng 4- 5mm). Khi bản gel đông hoàn toàn (khoảng 30 phút), nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khuôn, khi đó trên bản gel xuất hiện các giếng. Đặt cả khuôn và bản gel vào bồn điện di.
Tiến hành điện di: Trước hết chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 1µl đệm tải 10X trộn chung vơi 5µl plasmid DNA. Dùng micropipet cho 15µl mẫu vào giếng theo thứ tự đã đánh dấu trên bản vẽ trên giấy để ghi nhớ. Chừa 1 giếng trống để cho thang DNA. Tiến chạy điện di khoảng 25 phút ở dòng điện 135V.
Đọc kết quả điện di: Sau khi chạy xong (khi thấy có vệt màu xanh cách giếng khoảng 2-2,5cm), lấy bản gel ra khỏi máy điện di. Xem các band DNA dưới tia sáng của đèn UV. Căn cứ vào thang DNA chuẩn, để xác định kích thước.
2.4.6. Tạo chủng E.coli Mach1 ™ -T1R mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ mã hóa beta-galactosidase LacZ mã hóa beta-galactosidase
Chúng tôi sử dụng bộ kit “TOPO® XL PCR Cloning kit” để chèn đoạn gen lacZ vào plasmid pCR-XL-TOPO®.
Nguyên tắc hoạt động của bộ kit là đoạn DNA được tổng hợp nhờ men Taq
polymerase nên luôn luôn được thêm nucleotide A ở đầu tận 3’, do vậy nên đoạn gen lacZ dễ dàng được chèn vào plasmid TOPO (pCR-XL-TOPO ®) đã được duỗi
Trần Đức Thụy
thẳng với hai đầu lệch 5’có nucleotide T. Trên plasmid TOPO này, men topoisomerase I được nối đồng hóa trị trên trình tự tận CCCTT của plasmid, và chính nhờ vậy nên một khi đoạn gen lacZ được chèn vào, phản ứng nối sẽ lập tức xảy ra và năng lượng cho phản ứng nối được cung cấp từ sự bẻ gãy cầu nối phosphodiester giữa phospho với gốc tyrosyl của men topoisomerase I.
2.4.6.1. Thu nhận gen LacZ
Khuếch đại gen LacZ bằng Pfu DNA polymerase
Quy trình PCR thu gen LacZ từ plasmid pAc5.1/V5-HisB/lacZ: do kích thước đoạn DNA quan tâm lớn (hơn 3kb), để đảm bảo quá trình khuếch đại ít gặp lỗi trong việc gắn các dNTPs vào, chúng tôi sử dụng enzym Pfu DNA polymerase trong giai đoạn đầu khuếch đại như sau:
- Chuẩn bị phản ứng theo thể tích như sau trong eppendorf:
DW 23.5µl
Buffer 10x 5µl
Hình 2.5. Năng lượng để nối đoạn DNA-LacZ vào plasmid TOPO
được cung cấp từ cầu nối phosphodiester giữa photpho với gốc tyorsyl của men topoisomerase 1
Trần Đức Thụy
F-XhoI-BetaGal (10µM) 4µl
R-HindIII-BetaGal (10µM) 4µl
pAc5.1/V5-HisB/lacZ 5µl
dNTP (2.5mM) 4µl
Pfu DNA polymerase 1µl
Total 50µl
- Mix nhẹ hỗn hợp, spin down hỗn hợp xuống đáy eppendorf, khởi động máy luân nhiệt và chạy chương trình đã được cài đặt sẵn, chờ cho thông báo nhiệt độ eppendorf lên 94oC ngay lập tức bỏ eppendorf vào.
- Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo chu trình:
01 chu kỳ 94o C trong 3 phút 25 chu kỳ: 94oC trong 30 giây 55oC trong 30 giây 72o C trong 3 phút 40 giây 01 chu kỳ 72o C trong 10 phút
- Điện di trên gel agarose 0,8% kiểm tra vạch khuếch đại
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit GFX
Để thuận tiện, chúng tôi sử dụng bộ kit “illustra GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit” cho tinh sạch sản phẩm PCR
Dùng eppendorf 1,5ml sạch, hút toàn bộ dịch sản phẩm PCR khuếch đại đoan gen LacZ. Thêm 500µl Capture buffer, dùng tay búng vào eppendorf cho hỗn hợp đều, ly tâm nhẹ để dịch lắng xuống đáy eppendorf. Hút toàn bộ hỗn hợp dịch cho vào cột GFX được đặt trong một cột thu hồi, ly tâm 13000 rpm/30s đổ dịch trong cột thu hồi, DNA được bám lại trên màng silica của cột GFX. Thêm 500µl
Trần Đức Thụy
dịch rửa Wash buffer tới cột GFX, ly tâm 13000rpm/30s và đổ dịch thu được trong cột thu hồi đi. Đặt cột GFX qua một eppendorf sạch mới, thêm 40µl dịch dung giải Elute buffer 3B vào giữa cột GFX, tránh dính dịch trên thành cột, ủ nhiệt độ phòng 1 phút để dung giải DNA. Ly tâm 13000rpm/1 phút bỏ cột GFX đi thu gen LacZ tinh sạch trong eppendorf.
Kéo dài đầu 3’ gen LacZ bằng Taq DNA polymerase
Sau giai đoạn khuếch đại trên chúng tôi thực hiện phản ứng kéo dài đầu 3’ đoạn DNA lacZ với sự hiện diện của Taq polymerase. Sản phẩm PCR khuếch đại bằng pfu polymerase đã đảm bảo kích thước, sau khi được tinh sạch qua cột GFX để loại bỏ các chất không mong muốn, chúng tôi thực hiện phản ứng kéo dài đầu 3’ với
Taq polymerase có thành phần như sau:
DW 30,75µl
purified PCR product (gen LacZ) 10µl Taq DNA polymerase buffer 10X(-MgCl2) 5µl
MgCl2 (50mM) 1,25µl
10mM dATP 2µl
Taq DNA polymerase 1µl
Total 50µl
Chạy chương trình PCR giai đoạn kéo dài 720C 2 giờ. Tiến hành tinh sạch và tạo dòng gen LacZ như các bước tiếp theo phía dưới.
Tinh sạch sản phẩm PCR dùng gel agarose điện di với crystal violet Trong phương pháp truyền thống DNA thường được tinh sạch trên gel agarose điện di với ethidium bromide, quan sát DNA dưới tia UV có thể phá hủy chúng do đó làm giảm hiệu quả tạo dòng đáng kể. Để tránh làm DNA bị hư hại chúng tôi tiến hành điện di và tinh sạch sản phẩm PCR trên gel agarose điện di dùng
Trần Đức Thụy
crystal violet thay cho ethidium bromide, vì thế mọi thao tác có thể diễn ra ở ánh sáng thường, bảo đảm giảm thiểu tối đa sự hư hỏng DNA.
Chuẩn bị gel agarose 8% như sau: Cân 0,4g agarose đổ vào erlen có chứa 50ml TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng đến khi gel trong. Để nguội ở ngoài nhiệt độ phòng 5 phút, bổ sung 30µl dung dịch crystal violet 2mg/ml và lắc đều. Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, đổ gel vào khuôn cho đạt được bề dày mong muốn (khoảng 4-5mm). Khi bản gel đông hoàn toàn (khoảng 30 phút), nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khuôn, đặt khuôn vào bể điện di
Tiến hành điện di: thêm 8µl 6X Crystal Violet Loading Buffer vào 40µl sản phẩm PCR, dùng micropipet hút nhả cho đều và cho mẫu vào giếng. Chạy điện di ở 80V. Quan sát thấy vạch sản phẩm PCR màu xanh di chuyển hơn một phần tư quãng đường gel thì dừng điện di.
Tinh sạch thu sản phẩm PCR (gen LacZ) từ gel: để quan sát rõ vạch, ta đặt gel lên trên máy uv bật chế độ ánh sáng huỳnh quang. Dùng lưỡi dao lam sạch cẩn thận cắt băng DNA ra khỏi gel. Bỏ vào eppendorf 1,5ml sạch đã biết trước khối lượng và cân để xác định khối lượng băng DNA. Bổ sung 2,5 lần lượng sodium iodide 6,6M (1µl~1mg), vortex cho đều sau đó ủ 500C cho đến khi gel tan chảy hoàn toàn. Đặt tube ở nhiệt độ phòng và thêm 1,5 lần lượng Binding Buffer và trộn đều, dùng micropipette hút toàn bộ lượng dịch này cho vào cột tinh sạch S.N.A.P ™ đã được đặt trong cột thu hồi (collection vial). Ly tâm 3000rpm/30s ở nhiệt độ phòng, đổ dịch trong cột thu hồi vào ngược cột tinh sạch S.N.A.P ™ và ly tâm như trên. Đổ dịch trong cột thu hồi đi, rửa cột bằng cách cho 400µl 1X Final Wash vào cột tinh sạch S.N.A.P ™, ly tâm 3000rpm/30s ở nhiệt độ phòng. Tương tự rửa lại một lần nữa, đổ dịch đi và làm khô cột S.N.A.P ™ bằng ly tâm 13000rpm/1 phút. Chuyển cột S.N.A.P ™ đến eppendorf sạch và thêm 40µl TE buffer ủ 1 đến 2 phút nhiệt độ phòng, ly tâm 13000rpm/phút thu gen LacZ.
Lấy 10 µl điện di trên gel agarose với ethidium bromide để kiểm tra kết quả, phần còn lại bảo quản -200C chờ sử dụng.
Trần Đức Thụy
2.4.6.2. Thiết lập phản ứng nối gen LacZ vào plasmid pCR®-XL-TOPO®
Do gen LacZ được tinh sạch và được Taq polymerse gắn thêm đuôi poly A vào đẩu tận 3’ chúng có thể được gắn dễ dàng vào plasmid pCR®
-XL-TOPO® vector ở dạng duỗi thẳng với hai đầu lệch 5’ có nucleotide T.
Phản ứng nối thực hiện trong eppendorf 1,5ml với lượng như sau: Gen LacZ đã tinh sạch 4µl
Plasmid pCR®-XL-TOPO® 1µl
Tổng cộng 5µl
Dùng tay búng nhẹ eppendorf cho hỗn hợp đều, ủ ở 250C 5 phút để phản ứng nối xảy ra. Bổ sung thêm 1µl dung dịch làm dừng phản ứng 6X TOPO® Cloning Stop Solution, ủ nhiệt độ phòng một vài giây và đặt eppendorf lên đá. Làm tương tự với đối chứng âm được thay gen LacZ đã tinh sạch bằng nước cất hai lần vô trùng. Sản phẩm nối gọi là plasmid pCR®-XL-TOPO®/LacZ.
2.4.6.3. Điện biến nạp plasmid pCR®-XL-TOPO®/LacZ vào tế bào E.coli
Mach1™ -T1R khả biến.
Trước khi thao tác cần chuẩn bị cuvet 0,1cm vô trùng làm lạnh trên đá 30 phút, môi trường S.O.C vô trùng rã đông, máy điện biến nạp chỉnh hiệu điện thế 1800v.
Dùng micropipette hút 2µl plasmid pCR®-XL-TOPO®/LacZ bỏ vào ống chứa tế bào E.coli khả biến One Shot® electrocompetent cells, dùng tay búng nhẹ ống cho đều (không dùng pipet, tránh tạo bọt khí). Cẩn thận chuyển toàn bộ dịch này vào khe của cuvet 0,1cm vô trùng đã được làm lạnh sẵn trên đá. Nhanh tay chuyển cuvet vào giá đỡ cố định cuvet, đưa giá đỡ này vào máy điện biến nạp.
Vận hành máy bằng cách nhấn hai lần nút PULSE, chờ khi nghe thấy tiếng kêu kéo dài báo hiệu thì lấy giá đỡ cuvet ra và đưa cuvet vào tủ cấy vô trùng, bổ
Trần Đức Thụy
sung 450µl môi trường S.O.C, dùng micropipette hút toàn bộ dịch vào eppendorf 1,5 ml vô trùng mới, cấy lắc 200rpm/1h ở 370C.
Hút 100µl dịch nuôi cấy, cấy trải trên mặt thạch đĩa LB chứa 50µl kanamycin 370C qua đêm và chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp mang gen LacZ quan tâm. Làm tương tự với đối chứng âm là plasmid pCR®-XL-TOPO®.
2.4.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ
2.4.7.1. Kiểm tra dòng mang Plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp PCR.
Chuẩn bị các thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc trong eppendorf như sau:
DW 14,75 µl
Mẫu khuẩn lạc 0µl
Taq DNA polymerase buffer 10X(-MgCl2) 2,5 µl
MgCl2 (50mM) 1,25µl
F-XhoI-BetaGal (10µM) 2µl
R-HindIII-BetaGal (10µM) 2µl
dNTP (2,5mM) 2µl
Taq DNA polymerase 0,5µl
Tổng thể tích 25µl
Chọn ngẫu nhiên và đánh dấu vài khuẩn lạc, dùng tăm vô trùng cấy tương ứng qua đĩa LB-agar-Kanamicin đồng thời phần còn lại của khuẩn lạc cho vào eppendorf đã chuẩn bị ở trên. Đặt eppendorf này vào máy luân nhiệt tiến hành chạy theo chương trình nhiệt như phần 2.4.6.1.
Tiến hành chạy điện di trên gel agarose 0,8% với ethidium bromide để kiểm tra sản phẩm PCR.
Trần Đức Thụy
2.4.7.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ bằng enzym cắt giới hạn.
Từ kết quả PCR chúng tôi xác định được những khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ. Tiến hành tăng sinh những khuẩn lạc này trong ống nghiệm chứa 5ml LB có bổ sung 5µl kháng sinh kanamycin 1000x để đạt nồng độ cuối là 50µg Kanamycin/ml và cấy lắc 200rpm /370C qua đêm, ly tâm thu khuẩn lạc và trích biệt plasmid bằng bộ kit “AccuPrep® Plasmid mini Extraction kit” của Bioneer như phần 2.4.4.
Kiểm tra plasmid được trích biệt bằng enzym cắt giới hạn XhoI và HindIII
theo thành phần phản ứng sau: DW 14µl Buffer 3µl XhoI 1,5µl HindIII 1,5µl pCR®-XL-TOPO®/LacZ 10µl Tổng cộng 30µl
Ủ hỗn hợp ở 370C/1h tạo điều kiện tối ưu cho hai enzym này hoạt động. Chạy điện di trên gel agarose-ethidum bromide 0,8% cho hai vạch là 3,5kb tương ứng với plasmid pCR®-XL-TOPO® dạng mở vòng và vạch 3,1kb tương ứng với gen LacZ.
Với những mẫu cho kết quả rõ ràng được chúng tôi chọn và gửi đi giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) để khẳng định lại kết quả.
2.4.8. Tinh sạch thu băng LacZ trên gel agarose điện di với crystal violet
Để làm tăng hiệu suất việc tạo dòng chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trên gel agarose điện di dùng crystal violet thay cho ethidium bromide.
Trần Đức Thụy
Chuẩn bị gel agarose 0,8%, thêm 6µl 6X Crystal Violet loading buffer vào 30µl sản phẩm PCR, dùng micropipet hút nhả cho đều và cho mẫu vào giếng. Chạy điện di ở 80V và quan sát thấy hai vạch điện di màu xanh 3,5kb tương ứng với plasmid pCR®-XL-TOPO® dạng mở vòng và vạch 3,1kb tương ứng với gen LacZ di