Khuếch đại gen LacZ bằng Pfu DNA polymerase
Quy trình PCR thu gen LacZ từ plasmid pAc5.1/V5-HisB/lacZ: do kích thước đoạn DNA quan tâm lớn (hơn 3kb), để đảm bảo quá trình khuếch đại ít gặp lỗi trong việc gắn các dNTPs vào, chúng tôi sử dụng enzym Pfu DNA polymerase trong giai đoạn đầu khuếch đại như sau:
- Chuẩn bị phản ứng theo thể tích như sau trong eppendorf:
DW 23.5µl
Buffer 10x 5µl
Hình 2.5. Năng lượng để nối đoạn DNA-LacZ vào plasmid TOPO
được cung cấp từ cầu nối phosphodiester giữa photpho với gốc tyorsyl của men topoisomerase 1
Trần Đức Thụy
F-XhoI-BetaGal (10µM) 4µl
R-HindIII-BetaGal (10µM) 4µl
pAc5.1/V5-HisB/lacZ 5µl
dNTP (2.5mM) 4µl
Pfu DNA polymerase 1µl
Total 50µl
- Mix nhẹ hỗn hợp, spin down hỗn hợp xuống đáy eppendorf, khởi động máy luân nhiệt và chạy chương trình đã được cài đặt sẵn, chờ cho thông báo nhiệt độ eppendorf lên 94oC ngay lập tức bỏ eppendorf vào.
- Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo chu trình:
01 chu kỳ 94o C trong 3 phút 25 chu kỳ: 94oC trong 30 giây 55oC trong 30 giây 72o C trong 3 phút 40 giây 01 chu kỳ 72o C trong 10 phút
- Điện di trên gel agarose 0,8% kiểm tra vạch khuếch đại
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit GFX
Để thuận tiện, chúng tôi sử dụng bộ kit “illustra GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit” cho tinh sạch sản phẩm PCR
Dùng eppendorf 1,5ml sạch, hút toàn bộ dịch sản phẩm PCR khuếch đại đoan gen LacZ. Thêm 500µl Capture buffer, dùng tay búng vào eppendorf cho hỗn hợp đều, ly tâm nhẹ để dịch lắng xuống đáy eppendorf. Hút toàn bộ hỗn hợp dịch cho vào cột GFX được đặt trong một cột thu hồi, ly tâm 13000 rpm/30s đổ dịch trong cột thu hồi, DNA được bám lại trên màng silica của cột GFX. Thêm 500µl
Trần Đức Thụy
dịch rửa Wash buffer tới cột GFX, ly tâm 13000rpm/30s và đổ dịch thu được trong cột thu hồi đi. Đặt cột GFX qua một eppendorf sạch mới, thêm 40µl dịch dung giải Elute buffer 3B vào giữa cột GFX, tránh dính dịch trên thành cột, ủ nhiệt độ phòng 1 phút để dung giải DNA. Ly tâm 13000rpm/1 phút bỏ cột GFX đi thu gen LacZ tinh sạch trong eppendorf.
Kéo dài đầu 3’ gen LacZ bằng Taq DNA polymerase
Sau giai đoạn khuếch đại trên chúng tôi thực hiện phản ứng kéo dài đầu 3’ đoạn DNA lacZ với sự hiện diện của Taq polymerase. Sản phẩm PCR khuếch đại bằng pfu polymerase đã đảm bảo kích thước, sau khi được tinh sạch qua cột GFX để loại bỏ các chất không mong muốn, chúng tôi thực hiện phản ứng kéo dài đầu 3’ với
Taq polymerase có thành phần như sau:
DW 30,75µl
purified PCR product (gen LacZ) 10µl Taq DNA polymerase buffer 10X(-MgCl2) 5µl
MgCl2 (50mM) 1,25µl
10mM dATP 2µl
Taq DNA polymerase 1µl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Total 50µl
Chạy chương trình PCR giai đoạn kéo dài 720C 2 giờ. Tiến hành tinh sạch và tạo dòng gen LacZ như các bước tiếp theo phía dưới.
Tinh sạch sản phẩm PCR dùng gel agarose điện di với crystal violet Trong phương pháp truyền thống DNA thường được tinh sạch trên gel agarose điện di với ethidium bromide, quan sát DNA dưới tia UV có thể phá hủy chúng do đó làm giảm hiệu quả tạo dòng đáng kể. Để tránh làm DNA bị hư hại chúng tôi tiến hành điện di và tinh sạch sản phẩm PCR trên gel agarose điện di dùng
Trần Đức Thụy
crystal violet thay cho ethidium bromide, vì thế mọi thao tác có thể diễn ra ở ánh sáng thường, bảo đảm giảm thiểu tối đa sự hư hỏng DNA.
Chuẩn bị gel agarose 8% như sau: Cân 0,4g agarose đổ vào erlen có chứa 50ml TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng đến khi gel trong. Để nguội ở ngoài nhiệt độ phòng 5 phút, bổ sung 30µl dung dịch crystal violet 2mg/ml và lắc đều. Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, đổ gel vào khuôn cho đạt được bề dày mong muốn (khoảng 4-5mm). Khi bản gel đông hoàn toàn (khoảng 30 phút), nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khuôn, đặt khuôn vào bể điện di
Tiến hành điện di: thêm 8µl 6X Crystal Violet Loading Buffer vào 40µl sản phẩm PCR, dùng micropipet hút nhả cho đều và cho mẫu vào giếng. Chạy điện di ở 80V. Quan sát thấy vạch sản phẩm PCR màu xanh di chuyển hơn một phần tư quãng đường gel thì dừng điện di.
Tinh sạch thu sản phẩm PCR (gen LacZ) từ gel: để quan sát rõ vạch, ta đặt gel lên trên máy uv bật chế độ ánh sáng huỳnh quang. Dùng lưỡi dao lam sạch cẩn thận cắt băng DNA ra khỏi gel. Bỏ vào eppendorf 1,5ml sạch đã biết trước khối lượng và cân để xác định khối lượng băng DNA. Bổ sung 2,5 lần lượng sodium iodide 6,6M (1µl~1mg), vortex cho đều sau đó ủ 500C cho đến khi gel tan chảy hoàn toàn. Đặt tube ở nhiệt độ phòng và thêm 1,5 lần lượng Binding Buffer và trộn đều, dùng micropipette hút toàn bộ lượng dịch này cho vào cột tinh sạch S.N.A.P ™ đã được đặt trong cột thu hồi (collection vial). Ly tâm 3000rpm/30s ở nhiệt độ phòng, đổ dịch trong cột thu hồi vào ngược cột tinh sạch S.N.A.P ™ và ly tâm như trên. Đổ dịch trong cột thu hồi đi, rửa cột bằng cách cho 400µl 1X Final Wash vào cột tinh sạch S.N.A.P ™, ly tâm 3000rpm/30s ở nhiệt độ phòng. Tương tự rửa lại một lần nữa, đổ dịch đi và làm khô cột S.N.A.P ™ bằng ly tâm 13000rpm/1 phút. Chuyển cột S.N.A.P ™ đến eppendorf sạch và thêm 40µl TE buffer ủ 1 đến 2 phút nhiệt độ phòng, ly tâm 13000rpm/phút thu gen LacZ.
Lấy 10 µl điện di trên gel agarose với ethidium bromide để kiểm tra kết quả, phần còn lại bảo quản -200C chờ sử dụng.
Trần Đức Thụy