Do enzym beta-galactosidase thủy phân lactose thành glucose, galactose , đồng thời nó còn có khả năng thực hiện phản ứng chuyển nhóm tạo hợp chất GOS nên chúng tôi thử khả năng tạo GOS với enzym tái tổ hợp 6xHis-betagalactosidase chúng tôi thu được. Kết quả được xác định qua sắc ký lỏng cao áp HPLC, tuy nhiên phương pháp HPLC chỉ cho biết các chất có thời gian lưu xác định biết trước nên chúng tôi sẽ phải sử dụng thêm phương pháp loại suy để kết luận.
Hoạt tính β-galactosidase cao nhất (U/mL) Nguồn Tác giả Tạp chí 14 Penicillium crysogenum Nagy et al Protein Expression Purification, 21 (2001), 24- 29
800 E.coli Martinez et al Enzyme Microb Technol, 22 (1998), 520-526. 890 E. coli Trình bày Trình bày
2050 L. acidophilus isolated from fermented ragi S K Akolkar, A D Sajgure and S S Lele Indian Journal of Biotechnology 5 (2006), 184-188 2319 E. coli: BL21(DE3) Synowiecki & Maciunska J Food Biochem, 26 (2002), 49-62
Trần Đức Thụy
Từ kết quả thu được cho thấy có điểm thời gian lưu của glucose 7,582; galactose 7,983 là hai sản phẩm được tạo ra sau phản ứng beta-galactosidase thủy phân lactose và thời gian lưu của lactose 6,817 là cơ chất chưa được phản ứng hết sau phản ứng (xem phụ lục 7), ngoài ra còn có thời gian lưu của những chất không biết rõ (2,623) và (5,489). Như vậy enzym 6xHis-betagalactosidase có khả năng thủy phân lactose tạo glucose, galactose đồng thời tạo ra những chất không rõ, có khả năng đây là các đoạn oligo-saccharide trong hỗn hợp GOS. (Hình 3.19).
Như vậy bước đầu chúng tôi đã xác định được 6xHis-betagalactosidase có khả năng thực hiện phản ứng chuyển nhóm tạo GOS từ đường lactose.
Hình 3.19. Kết quả chạy sắc ký lỏng HPLC cho thấy có sự tạo thành sản phẩm
glucose và galactose, đồng thời cũng có điểm thời gian lưu của chất lạ được cho là một trong những hỗn hợp của GOS
Trần Đức Thụy
Chƣơng 4
Trần Đức Thụy
4.1 Kết Luận
Từ các kết quả thu được trên đây chúng tôi rút ra một vài kết luận sau:
- Đã tổng hợp thành công gen mã hóa beta-galactosidase bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu.
- Chúng tôi đã tạo dòng thành công đoạn gen mã hóa beta-galactosidase dạng dung hợp vào vector pTrcHisB tạo vector pTrcHisB-LacZ và biến nạp thành công vector này vào chủng E.coli BL21(DE3) tạo dòng E.coli
BL21(DE3)/PtrcHisB-LacZ có khả năng biểu hiện beta-galactosidase ở dạng dung hợp 6xHis-betagalactosidase.
- Dòng E.coli BL21(DE3)/PtrcHisB-LacZ được thử khả năng sinh beta- galactosidase hoạt tính thủy phân X-Gal tạo màu.
- Đã thu nhận thành công 6xHis-betagalactosidase ở dạng thể tan từ dòng
E.coli BL21(DE3), có ý nghĩa quan trọng trong việc thu hồi sau này. - Xác định được nồng độ imidazol cần để thu 6xHis-betagalactosidase. - Thành công khả năng thủy phân lactose tạo GOS của enzym tái tổ hợp
6xHis-betagalactosidase.
- Xác định được điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu với 6xHis-betagalactosidase. - Bước đầu thành công trong việc thử khả năng tạo GOS từ enzym 6xHis-
betagalactosidase