E.coli BL21(DE3).
Plasmid pTrcHisB được thiết kế cho biểu hiện vượt mức protein tái tổ hợp, chứa trc promoter lai giữa vùng -35 trp promoter và vùng -10 lac promoter, bình thường bị ức chế bởi protein kìm hãm của gen lacIq. Khi có mặt IPTG trong môi trường nuôi cấy, lập tức phân tử IPTG liên kết ái lực với protein kìm hãm, làm thay đổi cấu trúc không gian của protein này. Vùng Ptrc promoter trên vector được giải phóng và được ARN polymerase nhận biết. Lúc này hệ pTrcHisB- LacZ trong E.coli BL21 chuyển sang quá trình phiên mã và dịch mã.
Để định tính sự biểu hiện 6xHis-betagalactosidase hoạt tính trong E. coli BL21, chúng tôi chọn hai dạng tế bào cấy vạch lên môi trường thạch LB-Amp-
Hình 3.14. Kết quả điện di SDS-PAGE cho vạch 110kDa, cho thấy
sự biểu hiện của 6xHis-betagalactosidase.
(Giếng 1: chứng (-), dòng E.coli BL21(DE3)/LacZ không cảm ứng IPTG; giếng 2,3,4,5,6,7,8. dòng E.coli BL21(DE3)/LacZ cảm ứng với IPTG).
Trần Đức Thụy
IPTG-Xgal: một dạng tế bào đối chứng E.coli BL21(DE3)/pTrcHisB không mang gen LacZ và một dạng tế bào E.coli BL21(DE3)/pTrcHisB-LacZ mang gen LacZ, cấy trên LB/ampicillin có bổ sung IPTG và X-Gal.
Kết quả là trên đĩa có một vạch khuẩn lạc màu xanh và một vạch khuẩn lạc màu trắng. Vạch khuẩn lạc màu xanh đậm do beta-galactosidase thuỷ phân X-gal tạo màu xanh là những tế bào chứa plasmid pTrcHisB-LacZ được biểu hiện, trong khi dòng đối chứng khuẩn lạc mọc được trên môi trường có kháng sinh ampicillin nhưng có màu trắng đục do thiếu enzym thủy phân X-gal. (Hình 3.15).
Mặt khác chúng tôi tiến hành chọn 4 khuẩn lạc E.coli BL21(DE3)/pTrcHisB- LacZ nuôi trong eppendorf chứa môi trường 2xYT/ampicillin. Cảm ứng cả bốn
Hình 3.15. Kết quả biểu hiện 6xHis-beta-galactosidase hoạt tính trong tế
bào E. coli BL21(DE3) cấy trên môi trường thạch LB-Amp- IPTG-Xgal.
(1. đối chứng (-) khuẩn lạc E.coli Bl21(DE3)/pTrcHisB màu trắng đục, 2. Khuẩn lạc E.coli BL21(DE3)/pTrcHisB-LacZ màu xanh mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ).
Trần Đức Thụy
eppendorf với IPTG, đồng thời cho vào ba eppendorf 2, 3, 4 X-Gal, eppendorf còn lại giữ nguyên. Tiếp tục nuôi cấy trong cùng điều kiện như trên thêm 4 giờ. Kết quả cho thấy 3 eppendorf bổ sung X-Gal cho màu xanh do dòng tế bào có khả năng tiết enzym beta-galactosidase thủy phân X-Gal tạo màu xanh. Eppendorf đối chứng không tạo màu do enzym beta-galactosidase được tạo ra nhưng không có X-Gal trong môi trường nên không có hiện tượng thủy phân X-Gal tạo màu. (Hình 3.14)
Như vậy chủng E.coli tái tổ hợp được chúng tôi tạo ra có khả năng sinh beta- galactosidase dạng dung hợp thủy phân được X-Gal.
1 2 3 4
Hình 3.16. Kết quả biểu hiện 6xHis-beta-galactosidase hoạt tính trong tế bào
E. coli BL21(DE3) cấy trên môi trường 2xYT-Amp-IPTG-Xgal. (1. đối chứng (-) khuẩn lạc E.coli Bl21(DE3)/pTrcHisB-LacZ trong môi trường không bổ sung X-gal cho màu trắng đục; 2,3,4. Khuẩn lạc E.coli BL21(DE3)/pTrcHisB-LacZ tạo enzym beta- galactosidase thủy phân X-Gal cho màu xanh).
Trần Đức Thụy