Chuẩn bị các thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc trong eppendorf như sau:
DW 14,75 µl
Mẫu khuẩn lạc 0µl
Taq DNA polymerase buffer 10X(-MgCl2) 2,5 µl
MgCl2 (50mM) 1,25µl
F-XhoI-BetaGal (10µM) 2µl
R-HindIII-BetaGal (10µM) 2µl
dNTP (2,5mM) 2µl
Taq DNA polymerase 0,5µl
Tổng thể tích 25µl
Chọn ngẫu nhiên và đánh dấu vài khuẩn lạc, dùng tăm vô trùng cấy tương ứng qua đĩa LB-agar-Kanamicin đồng thời phần còn lại của khuẩn lạc cho vào eppendorf đã chuẩn bị ở trên. Đặt eppendorf này vào máy luân nhiệt tiến hành chạy theo chương trình nhiệt như phần 2.4.6.1.
Tiến hành chạy điện di trên gel agarose 0,8% với ethidium bromide để kiểm tra sản phẩm PCR.
Trần Đức Thụy
2.4.7.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ bằng enzym cắt giới hạn.
Từ kết quả PCR chúng tôi xác định được những khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp pCR®-XL-TOPO®/LacZ. Tiến hành tăng sinh những khuẩn lạc này trong ống nghiệm chứa 5ml LB có bổ sung 5µl kháng sinh kanamycin 1000x để đạt nồng độ cuối là 50µg Kanamycin/ml và cấy lắc 200rpm /370C qua đêm, ly tâm thu khuẩn lạc và trích biệt plasmid bằng bộ kit “AccuPrep® Plasmid mini Extraction kit” của Bioneer như phần 2.4.4.
Kiểm tra plasmid được trích biệt bằng enzym cắt giới hạn XhoI và HindIII
theo thành phần phản ứng sau: DW 14µl Buffer 3µl XhoI 1,5µl HindIII 1,5µl pCR®-XL-TOPO®/LacZ 10µl Tổng cộng 30µl
Ủ hỗn hợp ở 370C/1h tạo điều kiện tối ưu cho hai enzym này hoạt động. Chạy điện di trên gel agarose-ethidum bromide 0,8% cho hai vạch là 3,5kb tương ứng với plasmid pCR®-XL-TOPO® dạng mở vòng và vạch 3,1kb tương ứng với gen LacZ.
Với những mẫu cho kết quả rõ ràng được chúng tôi chọn và gửi đi giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) để khẳng định lại kết quả.
2.4.8. Tinh sạch thu băng LacZ trên gel agarose điện di với crystal violet
Để làm tăng hiệu suất việc tạo dòng chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trên gel agarose điện di dùng crystal violet thay cho ethidium bromide.
Trần Đức Thụy
Chuẩn bị gel agarose 0,8%, thêm 6µl 6X Crystal Violet loading buffer vào 30µl sản phẩm PCR, dùng micropipet hút nhả cho đều và cho mẫu vào giếng. Chạy điện di ở 80V và quan sát thấy hai vạch điện di màu xanh 3,5kb tương ứng với plasmid pCR®-XL-TOPO® dạng mở vòng và vạch 3,1kb tương ứng với gen LacZ di chuyển khoảng một phần tư quãng đường gel thì dừng điện di.
Tinh sạch thu gen LacZ từ gel: để quan sát rõ vạch, ta đặt gel lên trên máy UV bật chế độ ánh sáng huỳnh quang. Dùng lưỡi dao lam sạch cẩn thận cắt băng LacZ ra khỏi gel. Thao tác như mục 2.4.6.1 thu gen LacZ.
Lấy 10 µl điện di trên gel agarose với ethidium bromide để kiểm tra kết quả, phần còn lại bảo quản -200C chờ sử dụng.
2.4.9. Tạo dòng đƣa gen LacZ vào plasmid pTrcHisB
2.4.9.1. Cắt tạo plasmid pTrcHisB đầu dính bằng hai enzym XhoI và HindIII
Chuẩn bị eppendorf 1,5ml sạch, đá bào, đặt các dung dịch trên đá bào và lần lượt hút dung dịch như sau:
DW 11µl Buffer 3µl XhoI 1,5µ HindIII 1,5µl pTrcHisB plasmid 3µl Tổng cộng 30µl
Dùng tay búng nhẹ vào thành eppendorf cho hỗn hợp đều, spin nhẹ hỗn hợp xuống đáy. Ủ 370C/2h cho phản ứng cắt xảy ra hoàn toàn, bất hoạt phản ứng bằng cách đặt eppendorf trong bể ổn nhiệt 600C/20 phút. Đặt eppendorf lên đá bào 2 phút, thêm 1µl alkalyn phosphatase và ủ 370C/1h để loại bỏ nhóm 5’ P tại hai đầu của plasmid
Trần Đức Thụy
Tiến hành điện di trên gel agarose 0,8%, cắt thu băng plasmid cho vào eppendorf 1,5ml sạch và thực hiện các bước tinh sạch bằng bộ kit “illustra GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit” như trình bày ở trên thu 40µl dịch plasmid pTrcHisB.
Lấy 5µl điện di ước lượng hàm lượng plasmid.
2.4.9.2. Thực hiện phản ứng nối gen LacZ vào plasmid pTrcHisB
Gen LacZ và plasmid pTrcHisB đã được tinh sạch và ước lượng hàm lượng DNA, trên cơ sở đó chúng tôi thực hiện phản ứng nối như sau:
DW 13µl T4 buffer 2µl LacZ-Inset 2µl pTrcHisB 2µl T4 ligase 1µl Tổng số 20µl
Ủ 250C qua đêm để phản ứng nối pTrcHisB-Lacz xảy ra, bảo quản 40C chờ dùng. Sản phẩm nối gọi là plasmid pTrcHisB-LacZ.
2.4.9.3. Điện biến nạp chuyển plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ vào E.coli
DH5α khả biến.
Cho toàn bộ 20µl plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ vào ống chứa 100µl tế bào E.coli khả biến được rã đông trên đá. Dùng tay búng nhẹ vào thành ống cho hỗn hợp trộn đều. Chuyển hỗn hợp này vào khe cuvet (cuvet đã được làm lạnh). Thao tác như phần 2.4.6.3 nhưng chọn lọc trên đĩa thạch được bổ sung ampicillin thay cho kanamycin.
Trần Đức Thụy
2.4.9.4. Kiểm tra dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ
Sau khi nuôi cấy, trên bề mặt đĩa xuất hiện các khuẩn lạc có khả năng kháng ampicillin. Tiến hành đánh dấu các khuẩn lạc và thực hiện:
Kiểm tra dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR.
Chuẩn bị các thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc trong eppendorf như sau
DW 14,75 µl
Mẫu khuẩn lạc 0µl
Taq DNA polymerase buffer 10X(-MgCl2) 2,5 µl
MgCl2 (50mM) 1,25µl
F-XhoI-BetaGal (10µM) 2µl
R-HindIII-BetaGal (10µM) 2µl
dNTP (2.5mM) 2µl
Taq DNA polymerase 0,5µl
Tổng thể tích 25µl
Chọn vài khuẩn lạc đã đánh dấu, dùng tăm vô trùng cấy tương ứng qua đĩa LB-agar-ampicillin đồng thời phần còn lại của khuẩn lạc cho vào eppendorf đã chuẩn bị ở trên. Đặt eppendorf vào máy luân nhiệt tiến hành chạy theo chương trình như phần 2.4.6.1.
Tiến hành chạy điện di trên gel agarose 0,8%/ethidium bromide để kiểm tra sản phẩm PCR.
Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ bằng enzym cắt giới hạn
Từ kết quả PCR chúng tôi xác định được những khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ, để khẳng định lại kết quả chúng tôi tiến hành cắt
Trần Đức Thụy
plasmid tái tổ hợp này bằng 2 enzym cắt hạn chế XhoI và HindIII. Đầu tiên lấy ống nghiệm chứa 5ml LB, bổ sung 5µl kháng sinh ampicillin 1000x để đạt nồng độ cuối là 100µg/ml. Lấy khuẩn lạc PCR dương tính cấy vào ống nghiệm, nuôi ở 370C 2000rpm/phút 12-16 giờ. Thu tế bào và trích biệt plasmid bằng bộ kit
“AccuPrep® Plasmid mini Extraction kit” của Bioneer như mục 2.4.4.
Kiểm tra plasmid trích biệt bằng enzym cắt giới hạn XhoI và HindIII theo thành phần phản ứng sau: DW 14µl Buffer 3µl XhoI 1,5µl HindIII 1,5µl pTrcHisB-LacZ 10µl tổng cộng 30µl
Ủ hỗn hợp ở 370C/1h, chạy điện di trên gel agarose 0,8% cho hai vạch là 4,4 kb tương ứng với plasmid pTrcHisB dạng mở vòng và vạch 3071bp tương ứng với gen LacZ.
Kiểm tra độ đồng khung plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ bằng phương pháp giải trình tự
Plasmid pTrcHisB-LacZ đã qua sàng lọc trên được đem tăng sinh và trích biệt plasmid, đem giải trình tự bằng cặp mồi F-XhoI-BetaGal. Trình tự thu được sẽ đem phân tích và so sánh độ tương đồng với trình tự LacZ trong plasmid pAc5.1/V5-HisB/LacZ bằng phần mêm jellyfish 3.31.
Trần Đức Thụy
2.4.10. Tạo dòng E.coli BL21(DE3) có khả năng biểu hiện beta-galactosidase hoạt tính. hoạt tính.
Plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ được trích biệt từ dòng E.coli DHα và được điện biến nạp vào dòng E.coli BL21 (DE3). Cấy trải trên đĩa thạch LB/ampicillin nuôi cấy 370C qua đêm. Tiến hành đồng thời một mẫu không có plasmid làm đối chứng âm. Chọn các khuẩn lạc mọc trên môi trường làm khuẩn lạc dự tuyển của chủng E.coli BL21(DE3) có mang plasmid pTrisHisB-LacZ. Tế bào chủ này có chứa đầy đủ các hệ thống enzym để giúp plasmid biểu hiện 6xHis- betagalactosidase ở dạng thể tan trong tế bào chất khi được cảm ứng bằng IPTG ở điều kiện thích hợp. Khuẩn lạc dòng tế bào này được cất giữ ở 40C hoặc giữ trong glycerol ở nhiệt độ -800C phục vụ cho các thí nghiệm nghiên cứu về sau.
2.4.11. Điện di SDS-PAGE 2.4.11.1. Nguyên tắc 2.4.11.1. Nguyên tắc
SDS-PAGE là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để phân tách protein tùy theo trọng lượng phân tử. SDS liên kết với phần kị nước của protein, cùng với 2- mercaptoethanol phá vỡ cấu trúc và cho phép chúng tồn tại bền vững trong dung dịch ở dạng thẳng. Đồng thời, SDS còn gắn vào phân tử protein làm cho chúng tích điện âm. Kết quả là protein tồn tại ở dạng thẳng của cấu trúc bậc 1 và tích điện âm. Khi đặt bản gel polyacrylamide dưới tác dụng của điện trường protein sẽ di chuyển qua các lỗ gel hướng về phía cực dương, kết quả là hình thành nên các vạch protein có kích thước khác nhau trên bản gel, có thể được phát hiện theo nhiều phương pháp.
2.4.11.2. Phƣơng pháp
Gel gồm hai lớp là stacking gel và separating gel được đổ dầy khoảng 0,75mm trong khoảng trống giữa hai miếng kiếng như sau:
Trần Đức Thụy
- Chuẩn bị separating gel 12% gồm: 1,6 ml dung dịch nước, 1,3 ml 1,5 M Tris pH 8,8; 2,0 ml 30% Acrylamide, 50 µl 10% SDS; 50 µl 10% APS, 2 µl TEMED. Lắc nhẹ cho đểu và dùng micropipette hút bỏ vào khe kiếng, hút nhẹ nhàng tránh tạo bọt khí. Hút 1ml nước bỏ lên bề mặt gel tạo bề mặt phẳng, chờ khoảng 30 phút gel sẽ đông.
- Đổ bỏ cạn phần nước, chuẩn bị stacking gel 5% như sau: 1.4 ml nước, 250 µl 1.0 M Tris pH 6,8; 330 µl 30% Acrylamide; 20 µl 10% SDS; 20 µl 10% APS; 2 µl TEMED. Lắc nhẹ cho đểu và dùng micropipette hút bỏ vào khe kiếng phía trên lớp separating gel, cắm lược (tránh tạo bọt khí). Chờ khoảng 30 phút cho đông gel, rút lược và tiến hành điện di.
Đặt miếng kiếng chứa gel vào giá mang, khóa giá mang cố định miếng kính. Chuẩn bị bồn điện di, đặt giá mang kính vào bồn điện di và đổ dịch điện di.
Mẫu sau khi được chuẩn bị, bổ sung dịch nạp mẫu chứa 2-mercaptoethanol và được đun 950C cách thủy 5 phút để biến tính protein. Nạp mẫu vào giếng và chạy điện di 100V khoảng 2 đến 3 giờ.
Lấy bản gel ra khỏi miếng kiếng, rửa nhẹ hai lần với nước cất. Nhuộm gel với dịch nhuộm Coomassie blue khoảng 1 giờ. Rửa miếng gel vài lần với nước cất, ngâm miếng gel trong dịch giải nhuộm đến khi gel trong (khoảng 1 đến 2 giờ). Quan sát bản gel trên hộp đèn phát ánh sáng huỳnh quang.
2.4.12. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis-betagalactosidase betagalactosidase
2.4.12.1. Cảm ứng biểu hiện
Khuẩn lạc E.coli BL21(DE3)-LacZ được nuôi cấy trong môi trường chứa 4ml 2xYT có bổ sung 100µg/ml ampicillin, nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 370C đến khi OD600 = 0,8 và bổ sung IPTG đạt nồng độ 1mM. Tiếp tục nuôi cấy 4 giờ, lấy 3ml
Trần Đức Thụy
dịch ly tâm lạnh 40C 10,000rpm/10 phút thu sinh khối tế bào, 1ml dịch còn lại làm tương tự thu phần sinh khối tế bào và dịch nổi để làm các bước tiếp theo.
2.4.12.2. Kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-betagalactosidase bằng phƣơng pháp SDS-PAGE SDS-PAGE
Mẫu điện di được chuẩn bị bằng cách huyền phù lượng sinh khối tế bào thu từ 1ml dịch nuôi cấy trên trong 100µl đệm PBS 1X để đạt nồng độ 10X. Hút 20µl dịch huyền phù vào eppendorf, bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng.,điện di SDS-PAGE 100v kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosidase với thang protein chuẩn.
2.4.12.3. Kiểm tra phân đoạn chứa 6xHis-betagalactosidase
Phân đoạn môi trường nuôi cấy
Hút 1000µl dịch nổi thu bước 2.4.12.1 vào eppendorf, tủa thu protein (nếu có) bằng cách 100µl TCA 100% vortex 15s và đặt eppendorf trên đá bào 15 phút, ly tâm lạnh 13000 rpm/15 phút và đổ bỏ phần dịch. Phần cặn thu được rửa hai lần với acetone bằng cách thêm 100µl acetone, búng nhẹ vào thành eppendorf và ly tâm lạnh 13000rpm/5 phút đổ phần dịch. Ủ khô phần cặn ở nhiệt độ phòng 1 giờ và huyền phù trong 100µl đệm PBS1X.
Dịch điện di được chuẩn bị bằng cách hút 20µl dịch protein bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng và điện di 100V kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosidase với thang protein chuẩn.
Phân đoạn periplasmic trong tế bào E.coli BL21(DE3)-LacZ
Huyền phù lượng sinh khối tế bào thu được từ ly tâm 3ml dịch nuôi cấy bước 2.4.12.1 trong 3ml đệm (30 mM Tris-HCl, 20% sucrose, pH 8,0), thêm 6 µl 0.5M EDTA, pH 8 đạt nồng độ 1mM. Lắc nhẹ 10 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm lạnh
Trần Đức Thụy
40C 10,000 rpm/10 phút thu phần cặn. Huyền phù phần cặn trong 3ml MgSO45mM làm lạnh sẵn, lắc nhẹ trên đá bào 10 phút để những protein periplasmic phóng thích vào trong dịch. Ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút để lắng cặn, hút phần dịch nổi tiến hành điện di SDS-PAGE. Phần cặn bảo quản 00C làm các bước tiếp theo.
Dịch điện di được chuẩn bị bằng cách hút 20µl dịch protein bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng. Điện di 100V kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosidase với thang protein chuẩn.
Phân đoạn thể tan trong tế bào chất (soluble cytoplasmic fraction)
Rửa sạch phần cặn thu trong bước lấy phân vung periplasmic với 1ml PBS 1X ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút. Huyền phù trong 300µl đệm STE 1X làm lạnh sẵn, ly giải tế bào với 30µl lysozym 10mg/ml, ủ trên đá bào 15 phút, phá màng tế bào trong sóng siêu âm 10 phút. Ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút thu phần dịch nổi chứa protein 6xHis-betagalactosidase (nếu có), bổ sung triton-x100 đạt nồng độ cuối 1%. Phần cặn sau ly tâm được bảo quản 00C chờ làm bước tiếp theo.
Dịch điện di được chuẩn bị bằng cách hút 20µl dịch protein bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng. Điện di 100v kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosidase với thang protein chuẩn.
Phân đoạn thể vùi trong tế bào chất (insoluble cytoplasmic fraction)
Phần cặn thu sau ly tâm thu bước trên được rửa sạch ba lần với 1ml PBS 1X ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút. Huyền phù trong 300µl đệm STE 1X làm lạnh sẵn, bổ sung 0,5% 2-mercaptoethanol và 0,5% sarkosyl (stock 20%), phá màng thể vùi trong sóng siêu âm 10 phút. Ly tâm lạnh 40C 10000rpm/10 phút thu phần dịch nổi chứa protein 6xHis-betagalactosidase nếu có, bổ sung triton-x100 đạt nồng độ cuối 1%.
Trần Đức Thụy
Dịch điện di được chuẩn bị bằng cách hút 20µl dịch protein bổ sung thêm 5µl dịch nạp mẫu 5X, đun cách thủy 5 phút ở 950C. Nạp 20µl vào giếng. Điện di 100v kiểm tra sự hiện diện của băng 6xHis-betagalactosdiase với thang protein chuẩn.
2.4.13. Thử khả năng thu hồi 6xHis- betagalactosidase với hạt Ni-NTA, dùng Imidazol ở tỷ lệ khác nhau Imidazol ở tỷ lệ khác nhau
Hút 60µl dịch chứa hạt Ni-NTA vào eppendorf 1,5ml, rửa sạch hạt bằng cách cho 1ml PBS 1x làm lạnh sẵn vào, lộn ngược eppendorf vài lần, spin nhẹ thu hạt và đổ dịch nổi. Hạt được rửa 5 lần như trên đảm bảo loại hết ethanol. Bỏ vào 1ml dịch enzym, ủ lắc 80rpm/4 giờ nhiệt độ 250C. Do hạt niken có ái lực với đuôi 6xHis của enzym tái tổ hợp 6xHis-beta-galactosidase nên chúng tôi có thể thu được enzym. Tuy nhiên để tăng tính đặc hiệu trong thu hồi enzym, chúng tôi cũng bổ sung imidazol ở các nồng độ khác nhau như 5,0mM; 7,5mM và 10mM imidazol. Sau thời gian ủ lắc, chúng tôi tiến hành ly tâm nhẹ thu hạt và dịch nổi, hạt này sẽ được rửa 3 lần với đệm PBS1x (tương tự trên) để loại bỏ hết dịch nổi (dịch này có thể còn lượng enzym dư cần thu hồi chưa tạo liên kết với hạt Ni-NTA).
Tiến hành điện di SDS-PAGE bằng cách sau: với mẫu 5mM imidazol, hút 20µl dịch nổi vào eppendorf 1,5ml và 20µl hạt Ni-NTA vào eppendorf 1,5ml khác, lần lượt bỏ vào mỗi eppendorf 5µl dịch nạp mẫu, đun cách thủy 5 phút và nạp 20µl dịch mẫu này vào giếng. Làm tương tự với mẫu 7,5mM; 10mM imidazol. Chạy điện di 100V/ 2 đến 3 giờ. Gel sau khi chay điện di được nhuộm với coomassive blue và giải nhuộm. Quan sát trên đèn phát ánh sáng huỳnh quang để xem rõ vạch điện di.
2.4.14. Xác định nhiệt độ, pH tối ƣu cho enzym 6x-betagalactosidase