1.3.1. Cấu trúc GOS
GOS là hỗn hợp được sản xuất từ lactose gồm 2-8 đơn vị saccharide trong đó đơn vị cuối là thường là glucose, đơn vị còn lại là galactose hoặc disaccharide. GOS được tạo thành trong quá trình beta-galactosidase thủy phân lactose[7], [10].
Trần Đức Thụy
1.3.2. Cơ chế tổng hợp GOS
Beta-galactosidase được biết xúc tác phản ứng chuyển nhóm cũng như là phản ứng thủy phân tạo GOS. Sự thủy phân lactose chủ yếu xảy ra tại nồng độ lactose thấp trong khi GOS được tạo ra bởi phản ứng chuyển nhóm tăng khi tăng nồng độ của lactose [46].
Hiệu quả chuyển nhóm phụ thuộc vào nguồn enzym và điều kiện môi trường phản ứng. Tỷ lệ GOS thu được là khác nhau với những nguồn enzym khác nhau [54].
Phản ứng chuyển nhóm bao gồm: phản ứng chuyển nhóm nội phân tử (intramolecular reaction) và phản ứng chuyển nhóm liên phân tử (intermolecular reaction). Phản ứng chuyển nhóm nội phân tử hay chuyển nhóm galactosyl trực tiếp tới D-glucose tạo vùng đồng phân của phân tử lactose. Phản ứng chuyển nhóm liên phân tử là một lộ trình tạo disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides, và cuối cùng là sản xuất những phân tử GOS dài hơn từ lactose [30]. Sự ảnh hưởng giữa phân tử nhận galactosyl và vị trí hoạt động của enzym đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành những sản phẩm chuyển nhóm liên phân tử [43].
Trần Đức Thụy
1.3.3. Đặc điểm GOS
Thống kê lượng GOS sử dụng trên toàn cầu là 20.000 tấn (2007). Một vài thí nghiệm in vitro và in vivo đã chứng minh GOS ổn định và không bị thủy phân bởi hệ enzym tiêu hóa. Năm 1999 Van Loo và cộng sự chứng minh hơn 90% GOS đã qua hệ tiêu hóa xuống được ruột kết.
Luật ban hành tại Châu Âu gần đây cũng ghi nhận rằng “Những carbonhydrat polymer cấu tạo bởi ba hoặc nhiều đơn vị monomeric được bổ sung vào thực phẩm và không bị tiêu hóa, hấp thu bởi phần trên hệ tiêu hóa thì đã được chứng minh bằng khoa học có lợi cho cơ thể con người” [20].
Hiệu quả chính của GOS là sự ảnh hưởng của nó trên thành phần vi khuẩn và khả năng hoạt động của hệ vi khuẩn đường ruột. Ruột người chứa một cộng đồng vi sinh vật phức tạp gồm: vi khuẩn, vi sinh vật nhân điển hình, archaea, viruses, và thực khuẩn. Trong đó vi khuẩn chiếm đa số, ước tính khoảng 1014 tế bào vi khuẩn hiện diện tại ruột kết [6],[27]. Bộ gen của hệ vi sinh vật đường ruột ước tính nhiều hơn ít nhất một trăm lần bộ gen người tương ứng với mức độ hoạt động trao đổi chất sẽ gia tăng, điều đã được Gill và cộng sự ghi nhận [51]. Hoạt động trao đổi chất vi khuẩn bao gồm: khả năng chuyển hóa những saccharide khó tiêu từ thức ăn hằng ngày bằng cách lên men tạo những chuỗi ngắn acid béo khác nhau (SCFAs): tác động lên bộ gen tế bào chủ để kiểm soát năng lượng tiêu hao và năng lượng dự trữ; đóng góp vào một vài con đường chuyển hóa sinh học như sản xuất vitamin và isoprenoid; sản xuất những chất được ghi nhận có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe con người như CLA [49], peptide hoạt tính sinh học; điều chỉnh sự cân bằng đường ruột; khử trùng ruột qua đó giảm thiểu tiếp xúc với các chất độc hại có thể gây khối u ác tính [51]. SCFAs là một trong những chất quan trọng có khả năng duy trì hàng rào vật lý chống lại những tác nhân xâm lấn, khi được hấp thu vào trong máu nó tác động lên gan điều khiển quá trình chuyển hóa lipid và carbonhydrate cung cấp năng lượng cho cơ, thận, não [14].
Trần Đức Thụy
Hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột tương đối ổn định, tuy nhiên nó có thể bị ảnh hưởng do yếu tố kiểu gen, độ tuổi, khẩu phần ăn, và tình trạng sức khỏe [35]. Ba cách thường được sử dụng để khôi phục hệ vi sinh vật đường ruột là (1) bổ sung trực tiếp vi sinh vật đường ruột bằng vi khuẩn thay thế, “probiotics”;(2) dùng chế độ ăn chứa thành phần chọn lọc hệ vi khuẩn có ích, “prebiotic”; hoặc cách dùng kết hợp cả hai, “synbiotics” [24]. Prebiotic được định nghĩa là thành phần chọn lọc lên men kích thích cho phép thay đổi đặc hiệu cả tỷ lệ và/hoặc hoạt tính vi khuẩn đường tiêu hóa nhằm cải thiện sức khỏe con người [26].
Đặc tính chọn lọc của prebiotic được cho là liên quan đến việc làm bifidobacteria và lactobacilli phát triển nên gây ức chế sự phát triển của các nhóm vi khuẩn khác tại ruột kết [36]. Cùng với inulin, fructo-oligosaccharides, lactulose, GOS cũng là thành phần thực phẩm được xác minh là ổn định trong thành phần prebiotic từ nghiên cứu in vitro và in vivo ở động vật và người [47].
Phương pháp phòng bệnh hiệu quả nhất khi sử dụng GOS được biết là liên quan đến việc chọn lọc cơ chất cho bifidobacteria và lactobacilli lên men [48], [53]. Những ảnh hưởng về sức khỏe được báo cáo trước đây đã được nghiên cứu và xem xét lại bởi những nhà nghiên cứu khác gần đây như bảo vệ chống lại tiêm nhiễm đường ruột, tăng cường sự hấp thụ chất vô cơ, điều chỉnh hệ miễn dịch ngăn ngừa dị ứng và rối loạn kích thích ở ruột kết [52], hiệu quả dinh dưỡng của SCFAs trên biểu mô ruột kết, giảm trao đổi độc tố vi khuẩn dẫn đến làm giảm nhân tố nguy cơ gây ung thư ruột kết [25], [37].
GOS được bổ sung trong thành phần sữa: bifidobacteria và lactobacilli được biết hiện diện trong thành phần sữa sơ sinh tự nhiên lấy từ tuyến vú người, chiếm tỷ lệ rất cao khoảng 90% tổng lượng vi khuẩn [21]. Hàm lượng oligosaccharide trong sữa người cao đạt 8-12g/l, hơn gấp một trăm lần trong sữa bò [7], thành phần các oligosaccharide căn bản là lactose cộng với galactose hình thành ba loại GOS: 3’- galactosyl-lactose, 4’-galactosyl-lactose, and 6’-galactosyl-lactose [9]. Sự hiện diện tỷ lệ cao của bifidobacteria trong sữa trẻ tự nhiên được cho là do khả năng sử dụng
Trần Đức Thụy
các oligosaccharide trong sữa [40]. Sự ghi nhận ảnh hưởng của bifidogenic ở sữa người có thể là cơ sở củng cố để ứng dụng bổ sung GOS hoặc GOS kết hợp fructo- oligosaccharide vào sữa bò dùng tạo sản phẩm sữa cho trẻ [29].
1.3.4. Ứng dụng
GOS được sử dụng chủ yếu trong sữa dành cho trẻ, thực phẩm cho trẻ, hàm lượng bổ sung thường là 6-7,2g/l GOS cùng với 0,6-0,8 g/l FOS [47], [44]. GOS cũng được sử dụng trong các thực phẩm khác (nước cam, thực phẩm thay thế bữa ăn, thực phẩm cho người già và người bị bệnh, …). [4], [54]
GOS gần đây được bổ sung vào bánh mì cùng các loại bánh khác do đặc tính ổn định không bị cắt trong quá trình trộn men, nướng bánh và do khả năng giữ ẩm cao nên tạo kết cấu bánh, mùi vị bánh ngon hơn. Đặc biệt thực phẩm cho người già và người bệnh cũng là lĩnh vực hứa hẹn ứng dụng GOS.
GOS có đặc tính tương tự sucrose nhưng không bị ảnh hưởng bởi tuyến nước bọt, vi khuẩn miệng. Do không bị phân cắt và sử dụng, nên chúng đã được chứng minh là ít ảnh hưởng đến lượng glucose máu [45].
Bên cạnh lĩnh vực thực phẩm, những lĩnh vực khác như mỹ phẩm và dược phẩm cũng khai thác đặc tính sinh hóa và lý hóa của GOS. Ví dụ như prebiotic- oligosaccharides có khả năng kích thích chọn lọc vi khuẩn có ích trên da người. [31]. Dùng làm thực phẩm trong công nghiệp vật nuôi (heo, bò, gà) để cải thiện sức khỏe và sự phát triển vật nuôi [12]. Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giảm thiểu dùng kháng sinh, ngăn ngừa việc chết sớm. Ngoài ra nó cũng được ứng dụng trong việc ngăn sản xuất methane ở động vật nhai lại [38], [39].
1.4. Tế bào E.coli và sự biểu hiện protein tái tổ hợp 1.4.1. Đặc điểm E.coli 1.4.1. Đặc điểm E.coli
E.coli là loại vi khuẩn gram âm, hiếu khí tùy ý, hình que, có kích thước 0,3- 1,0 x 1,0-6,0µm. E.coli được tìm thấy khắp nơi trong tự nhiên, thời gian phát triển
Trần Đức Thụy
ngắn khoảng 20 phút cho một thế hệ, nhu cầu sử dụng dinh dưỡng đơn giản có thể sử dụng trong công nghiệp. Nhiệt độ sinh trưởng là 370
C, pH 6,0-7,0. Bộ gen E.coli
đã được giải trình tự và nghiên cứu kỹ nên người ta biết rõ về những đặc điểm sinh lý, sinh hóa và biến dưỡng. Ngoài ra với hệ vector phong phú, khi thao tác trên tế bào E.coli người ta dễ dàng chọn lựa được những vector thỏa mãn nhu cầu mà ở những tế bào chủ khác không thể có. Tùy theo đặc tính protein muốn biểu hiện trong vector nào mà người ta cũng có những chủng E.coli khác nhau [1].
1.4.2. Các chủng E.coli dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên thị trường hiện nay có nhiều chủng E.coli có chức năng biểu hiện tốt, ở đây chúng tôi nêu một vài chủng tiêu biểu.
Bảng 1.2. Các chủng E.coli thường dùng trong biểu hiện. [56]
Một số chủng E. coli biểu hiện thƣờng đƣợc sử dụng
Chủng Đặc điểm nổi bật
AD494 Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất BL21 Bất hoạt protease lon và ompT
BL21 trxB đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất bất hoạt protease lon và ompT
BL21 CodonPlus-RIL
Hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như AGG, AGA, AUA, CUA bất hoạt protease lon và
ompT
BLR Đột biến recA làm ổn định các vùng lặp bất hoạt protease
lon và ompT
C41/ C43 Đột biến dành cho biểu hiện protein màng
JM 83 Tiết protein tái tổ hợp ra vùng ngoại vi tế bào chất
Origami B Đột biến trxB/gor hỗ trợ cực tốt cho việc tạo thành liên kết disulfide ở tế bào chất bất hoạt protease lon và ompT
Rosetta-gami
Hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC và GGA bất hoạt protease lon và ompT đột biến trxB/gor hỗ trợ cực tốt cho việc tạo thành liên kết disulfide ở tế bào chất
Trần Đức Thụy
Chủng chủ E.coli BL21(DE3), {F-, ompT, hsdSB (rB–, mB–), gal, dcm} là chủng biểu hiện protein tốt, thường được dùng biểu hiện protein dung hợp với 6xHis bằng vector biểu hiện pTrcHisB. Chủng này bị đột biến khuyết sản phẩm
OmpT và lon nên hạn chế tối đa sự thủy phân không mong muốn của protein được tổng hợp [1].
1.5. Một vài hệ thống vector biểu hiện protein
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST
Tất cả các vector pGEX đều có đặc điểm chung là chứa lac promoter (Plac) điều khiển sự biểu hiện vượt mức gen nằm ở hạ lưu theo cơ chế kiểm soát âm cảm ứng IPTG. Họ pGEX gồm 13 vector.
GST (Glutathione S-Transferase) là họ enzym có thể chuyển nhóm S của glutathione vào những cơ chất như nitro và các hợp chất của halogen, làm cho chúng bị khử độc tính. Hệ thống pGEX biểu hiện protein tái tổ hợp dung hợp với GST. Trung tâm cơ chất của GST có ái lực cao đối với glutathione, giúp việc thu nhận protein tái tổ hợp dễ dàng. GST còn có vai trò trong sự phát hiện protein dung hợp với GST bằng phương pháp so màu dựa vào hoạt tính của GST trên cơ chất tạo sản phẩm có màu như CDNB (1-chloro-2-dinitrobenzene) hoặc dựa trên kháng thể đặc hiệu của GST [1].
1.5.2. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP-Hệ thống pMAL
Trong hệ thống này, gen mã hóa protein mục tiêu được chèn vào vector pMAL ở vùng hạ lưu từ gen malE, mã hóa cho protein kết gắn maltose, MBP (maltose Binding Protein). Hệ thống này sử dụng promoter mạnh Plac để biểu hiện một lượng protein dung hợp, sau đó được thu nhận bằng sắc ký ái lực dựa vào ái lực đặc trưng của MBP với amlose. Hệ thống pMAL có khả năng biểu hiện cả ở tế bào chất và chu chất với mức độ biểu hiện cao (100mg/L) trong E.coli và làm tăng tính tan của protein dung hợp [1].
Trần Đức Thụy
1.5.3. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP
Đặc điểm nổi bật của hệ thống IMPACT (Intein Mediated Pucrifiaction with an Affinity Chitin-binding) là tính năng tự cắt các đoạn protein dung hợp trong thu nhận và tinh chế protein tái tổ hợp. Phân tử intein này được biến đổi để có thể thực hiện hiện phản ứng tự cắt liên kết peptide khi được cảm ứng ở 40C với tác nhân DTT (1,4-Dithiothreitol), 2-mercaptoethanol hoặc cysteine.
Trong hệ thống này gen mã hóa intein thường nằm ở đầu 3’ của gen mục tiêu, tiếp theo là đoạn gen mã hóa cho vùng gắn chitin, chitin-binding domain (CBD), kích thước 5kDa từ Bacillus circulan. Khi được nạp vào cột chitin, protein dung hợp với CBP sẽ được giữ lại. Sau khi thực hiện phản ứng cắt của intein ở 40
C bởi DTT hoặc 2-mercaptoethanol, protein mục tiêu được ly giải khỏi cột [2]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.5.4. Hệ thống pTrcHis trong sản xuất protein tái tổ hợp dung hợp 6xHis
Hệ thống vector pTrcHis cho phép dòng hóa và biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homooligo histindine (6xHis) trong tế bào E.coli. Hệ thống pTrcHis gồm 4 vector pTrcHis A/B/C và pTrcHis/CAT cho mức biểu hiện protein cao nhờ trc promoter. pTrcHis vector chứa gen lacIq
mã hóa protein repressor cho phép ngăn cản hiệu quả sự phiên mã dòng gen được chèn vào tế bào E.coli bất chấp chủng vi khuẩn này có mang gen lacIq- hay lacIq+. Vector biểu hiện này chứa trình tự mã hóa thể 6xHis dung hợp với đầu N protein cần biểu hiện, đặc tính này hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu và còn giúp cho phát hiện protein mục tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể chuyên biệt với His-tag. Protein dạng dung hợp có thể được thu hồi trên 90% bằng cách hấp phụ lên cột sắc ký Ni2+
-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) nhờ tương tác giữa 6xHis và Ni2+ [1].
Trần Đức Thụy
Chƣơng 2
Trần Đức Thụy
2.1. Vật liệu
2.1.1. Gen mã hóa beta-galactosidase
Plasmid pAc5.1/V5-HisB/lacZ (Invitrogen), là vector được sử dụng biểu hiện protein ở tế bào côn trùng dài 8433bp chứa gen LacZ mã hóa β-galactosidase hoạt tính chúng tôi quan tâm. Gen LacZ nằm tại vị trí 2634 đến 5690 trên vector, thường dùng làm chỉ thị cho biết có sự biểu hiện protein quan tâm khi nhuộm với X-Gal.
2.1.2. Chủng vi sinh vật
Chủng E.coli DH5α (Clontech-Takara Bio), kiểu gen {deoR, endA1, gyrA96, hsdR17 (rK -,mK+), recA1, relA1, supE44, thi-1, Δ(lacZYA-argFV169), φ80δlacZΔM15, F-, λ-} dùng để tạo dòng gen.
Chủng Match1TM
-T1R E.coli (Invitrogen), kiểu gen {F-, φ80lacZΔM15, Δ (lacZYA-argF) U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK -,mK+), phoA, supE44, thi- 1, gyrA96, relA1, tonA} dùng cho tạo dòng thu plasmid, sàng lọc khuẩn lạc xanh trắng không cần cảm ứng IPTG.
Trần Đức Thụy
Chủng chủ E.coli BL21(DE3) (Invitrogen), có kiểu gen {F-, ompT, hsdSB (rB–, mB–), gal, dcm} được dùng để biểu hiện gen trong plasmid pTric HisB.
2.1.3. Plasmid dùng trong thí nghiệm
Plasmid pCR-XL-TOPO® dùng để tạo dòng sản phẩm PCR không cần phải ligase hay sử dụng mồi đặc biệt. Vector được cải tiến, chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp không cần cảm ứng IPTG do nó có chứa trình tự gen gây chết ccdB. Ngoài ra Vector còn chứa trình tự gen kháng kanamycin và zeocin giúp cho việc chọn dòng chính xác hơn [19].
Trần Đức Thụy
Plasmid pCR-XL-TOPO® cũng chứa vùng pUC ori giúp cho việc sao chép plasmid, promoter Plac, vùng MCS với nhiều trình tự cắt giới hạn thuận tiện và còn chứa hai trình tự mồi M13 và T7 phục vụ giải trình tự [19].
Plasmid pTrcHisB có kích thước 4404 nucleotide bao gồm trình tự sao chép pBR322 ori, gen kháng ampicillin, codon ATG khởi đầu dịch mã, trình tự trc promoter cho phép biểu hiện protein mức cao, trình tự 6 histidine ứng dụng trong tinh sạch protein tái tổ hợp, trình tự EK nhận diện cắt enterokinase, trình tự rrnBTT kết thúc phiên mã, trình tự lacO cho phép bám protein Lac repressor của gen lacIq
làm ngừng quá trình phiên mã. Vùng MCS cho phép chèn đoạn gen quan tâm chứa 6 vị trí cắt hạn chế [11]
Promoter Ptcr là dạng lai giữa vùng -35 của trp promoter với vùng -10 của lac promoter. Promoter lai cho phép biểu hiện protein mức cao tuy nhiên không liên tục nên có thể hạn chế tạo thể vùi trong quá trình phiên mã tạo protein [11].