Tế bào E.coli và sự biểu hiện protein tái tổ hợp

1.4.1. Đặc điểm E.coli

E.coli là loại vi khuẩn gram âm, hiếu khí tùy ý, hình que, có kích thước 0,3- 1,0 x 1,0-6,0µm. E.coli được tìm thấy khắp nơi trong tự nhiên, thời gian phát triển

Trần Đức Thụy

ngắn khoảng 20 phút cho một thế hệ, nhu cầu sử dụng dinh dưỡng đơn giản có thể sử dụng trong công nghiệp. Nhiệt độ sinh trưởng là 370

C, pH 6,0-7,0. Bộ gen E.coli

đã được giải trình tự và nghiên cứu kỹ nên người ta biết rõ về những đặc điểm sinh lý, sinh hóa và biến dưỡng. Ngoài ra với hệ vector phong phú, khi thao tác trên tế bào E.coli người ta dễ dàng chọn lựa được những vector thỏa mãn nhu cầu mà ở những tế bào chủ khác không thể có. Tùy theo đặc tính protein muốn biểu hiện trong vector nào mà người ta cũng có những chủng E.coli khác nhau [1].

1.4.2. Các chủng E.coli dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp

Trên thị trường hiện nay có nhiều chủng E.coli có chức năng biểu hiện tốt, ở đây chúng tôi nêu một vài chủng tiêu biểu.

Bảng 1.2. Các chủng E.coli thường dùng trong biểu hiện. [56]

Một số chủng E. coli biểu hiện thƣờng đƣợc sử dụng

Chủng Đặc điểm nổi bật

AD494 Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất BL21 Bất hoạt protease lon và ompT

BL21 trxB đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất bất hoạt protease lon và ompT

BL21 CodonPlus-RIL

Hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như AGG, AGA, AUA, CUA bất hoạt protease lon và

ompT

BLR Đột biến recA làm ổn định các vùng lặp bất hoạt protease

lon và ompT

C41/ C43 Đột biến dành cho biểu hiện protein màng

JM 83 Tiết protein tái tổ hợp ra vùng ngoại vi tế bào chất

Origami B Đột biến trxB/gor hỗ trợ cực tốt cho việc tạo thành liên kết disulfide ở tế bào chất bất hoạt protease lon và ompT

Rosetta-gami

Hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC và GGA bất hoạt protease lon và ompT đột biến trxB/gor hỗ trợ cực tốt cho việc tạo thành liên kết disulfide ở tế bào chất

Trần Đức Thụy

Chủng chủ E.coli BL21(DE3), {F-, ompT, hsdSB (rB–, mB–), gal, dcm} là chủng biểu hiện protein tốt, thường được dùng biểu hiện protein dung hợp với 6xHis bằng vector biểu hiện pTrcHisB. Chủng này bị đột biến khuyết sản phẩm

OmpT và lon nên hạn chế tối đa sự thủy phân không mong muốn của protein được tổng hợp [1].

1.5. Một vài hệ thống vector biểu hiện protein

1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST

Tất cả các vector pGEX đều có đặc điểm chung là chứa lac promoter (Plac) điều khiển sự biểu hiện vượt mức gen nằm ở hạ lưu theo cơ chế kiểm soát âm cảm ứng IPTG. Họ pGEX gồm 13 vector.

GST (Glutathione S-Transferase) là họ enzym có thể chuyển nhóm S của glutathione vào những cơ chất như nitro và các hợp chất của halogen, làm cho chúng bị khử độc tính. Hệ thống pGEX biểu hiện protein tái tổ hợp dung hợp với GST. Trung tâm cơ chất của GST có ái lực cao đối với glutathione, giúp việc thu nhận protein tái tổ hợp dễ dàng. GST còn có vai trò trong sự phát hiện protein dung hợp với GST bằng phương pháp so màu dựa vào hoạt tính của GST trên cơ chất tạo sản phẩm có màu như CDNB (1-chloro-2-dinitrobenzene) hoặc dựa trên kháng thể đặc hiệu của GST [1].

1.5.2. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP-Hệ thống pMAL

Trong hệ thống này, gen mã hóa protein mục tiêu được chèn vào vector pMAL ở vùng hạ lưu từ gen malE, mã hóa cho protein kết gắn maltose, MBP (maltose Binding Protein). Hệ thống này sử dụng promoter mạnh Plac để biểu hiện một lượng protein dung hợp, sau đó được thu nhận bằng sắc ký ái lực dựa vào ái lực đặc trưng của MBP với amlose. Hệ thống pMAL có khả năng biểu hiện cả ở tế bào chất và chu chất với mức độ biểu hiện cao (100mg/L) trong E.coli và làm tăng tính tan của protein dung hợp [1].

Trần Đức Thụy

1.5.3. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP

Đặc điểm nổi bật của hệ thống IMPACT (Intein Mediated Pucrifiaction with an Affinity Chitin-binding) là tính năng tự cắt các đoạn protein dung hợp trong thu nhận và tinh chế protein tái tổ hợp. Phân tử intein này được biến đổi để có thể thực hiện hiện phản ứng tự cắt liên kết peptide khi được cảm ứng ở 40C với tác nhân DTT (1,4-Dithiothreitol), 2-mercaptoethanol hoặc cysteine.

Trong hệ thống này gen mã hóa intein thường nằm ở đầu 3’ của gen mục tiêu, tiếp theo là đoạn gen mã hóa cho vùng gắn chitin, chitin-binding domain (CBD), kích thước 5kDa từ Bacillus circulan. Khi được nạp vào cột chitin, protein dung hợp với CBP sẽ được giữ lại. Sau khi thực hiện phản ứng cắt của intein ở 40

C bởi DTT hoặc 2-mercaptoethanol, protein mục tiêu được ly giải khỏi cột [2].

1.5.4. Hệ thống pTrcHis trong sản xuất protein tái tổ hợp dung hợp 6xHis

Hệ thống vector pTrcHis cho phép dòng hóa và biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homooligo histindine (6xHis) trong tế bào E.coli. Hệ thống pTrcHis gồm 4 vector pTrcHis A/B/C và pTrcHis/CAT cho mức biểu hiện protein cao nhờ trc promoter. pTrcHis vector chứa gen lacIq

mã hóa protein repressor cho phép ngăn cản hiệu quả sự phiên mã dòng gen được chèn vào tế bào E.coli bất chấp chủng vi khuẩn này có mang gen lacIq- hay lacIq+. Vector biểu hiện này chứa trình tự mã hóa thể 6xHis dung hợp với đầu N protein cần biểu hiện, đặc tính này hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu và còn giúp cho phát hiện protein mục tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể chuyên biệt với His-tag. Protein dạng dung hợp có thể được thu hồi trên 90% bằng cách hấp phụ lên cột sắc ký Ni2+

-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) nhờ tương tác giữa 6xHis và Ni2+ [1].

Trần Đức Thụy

Chƣơng 2

Trần Đức Thụy

2.1. Vật liệu

2.1.1. Gen mã hóa beta-galactosidase

Plasmid pAc5.1/V5-HisB/lacZ (Invitrogen), là vector được sử dụng biểu hiện protein ở tế bào côn trùng dài 8433bp chứa gen LacZ mã hóa β-galactosidase hoạt tính chúng tôi quan tâm. Gen LacZ nằm tại vị trí 2634 đến 5690 trên vector, thường dùng làm chỉ thị cho biết có sự biểu hiện protein quan tâm khi nhuộm với X-Gal.

2.1.2. Chủng vi sinh vật

Chủng E.coli DH5α (Clontech-Takara Bio), kiểu gen {deoR, endA1, gyrA96, hsdR17 (rK -,mK+), recA1, relA1, supE44, thi-1, Δ(lacZYA-argFV169), φ80δlacZΔM15, F-, λ-} dùng để tạo dòng gen.

Chủng Match1TM

-T1R E.coli (Invitrogen), kiểu gen {F-, φ80lacZΔM15, Δ (lacZYA-argF) U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK -,mK+), phoA, supE44, thi- 1, gyrA96, relA1, tonA} dùng cho tạo dòng thu plasmid, sàng lọc khuẩn lạc xanh trắng không cần cảm ứng IPTG.

Trần Đức Thụy

Chủng chủ E.coli BL21(DE3) (Invitrogen), có kiểu gen {F-, ompT, hsdSB (rB–, mB–), gal, dcm} được dùng để biểu hiện gen trong plasmid pTric HisB.

2.1.3. Plasmid dùng trong thí nghiệm

Plasmid pCR-XL-TOPO® dùng để tạo dòng sản phẩm PCR không cần phải ligase hay sử dụng mồi đặc biệt. Vector được cải tiến, chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp không cần cảm ứng IPTG do nó có chứa trình tự gen gây chết ccdB. Ngoài ra Vector còn chứa trình tự gen kháng kanamycin và zeocin giúp cho việc chọn dòng chính xác hơn [19].

Trần Đức Thụy

Plasmid pCR-XL-TOPO® cũng chứa vùng pUC ori giúp cho việc sao chép plasmid, promoter Plac, vùng MCS với nhiều trình tự cắt giới hạn thuận tiện và còn chứa hai trình tự mồi M13 và T7 phục vụ giải trình tự [19].

Plasmid pTrcHisB có kích thước 4404 nucleotide bao gồm trình tự sao chép pBR322 ori, gen kháng ampicillin, codon ATG khởi đầu dịch mã, trình tự trc promoter cho phép biểu hiện protein mức cao, trình tự 6 histidine ứng dụng trong tinh sạch protein tái tổ hợp, trình tự EK nhận diện cắt enterokinase, trình tự rrnBTT kết thúc phiên mã, trình tự lacO cho phép bám protein Lac repressor của gen lacIq

làm ngừng quá trình phiên mã. Vùng MCS cho phép chèn đoạn gen quan tâm chứa 6 vị trí cắt hạn chế [11]

Promoter Ptcr là dạng lai giữa vùng -35 của trp promoter với vùng -10 của lac promoter. Promoter lai cho phép biểu hiện protein mức cao tuy nhiên không liên tục nên có thể hạn chế tạo thể vùi trong quá trình phiên mã tạo protein [11].

Trần Đức Thụy

2.1.4. Mồi khuếch đại gen LacZ

. Mồi được thiết kế đảm bảo khuếch đại đoạn gen LacZ trên plasmid pAc5.1/V5HisB/LacZ. Mồi được cung cấp bởi công ty Invitrogen Singapore.

Mồi xuôi F-XhoI-BetaGal gồm 22 trình tự bắt cặp bắt cặp với gen LacZ, trình tự cắt XhoI và một nucleotide “G” được thêm vào phía đầu 5’ đảm bảo sau quá trình cắt gen LacZ được chèn đồng khung vào plasmid pTrHisB để biểu hiện.

Mồi ngược R-HindIII-BetaGal được thiết kế gồm 23 trình tự bắt cặp với gen LacZ, trình tự cắt HindIII và trình tự mã hóa stop codon UAG ở đầu 5’.

Bảng 2.1. Đặc tính mồi thiết kê khuếch đại gen LacZ

2.1.5. Thang phân tử dùng trong điện di DNA/RNA

- Thang phân tử lượng protein: 6500 kDa – 200,000 KDa (Sigma) - Thang DNA: 500bp DNA leader (Invitrogen)

Đặc tính F-XhoI-BetaGal R-HindIII-BetaGal

Trình tự 5’ – AGTC AGATCCCGT CGT TTTAC - 3’CTCGAGGATGAT 5’- CGC ACACCAGACCAACTGGT – 3’TTCGAACTATTTTTG Chiều dài (nucleotide) 33 35 %GC 49 46 Tm (0C) 64.4 64.4 Kích thước sản phẩm PCR 3071bp

Trần Đức Thụy

2.2. Dụng cụ - thiết bị

2.2.1. Dụng cụ thiết bị thông dụng

- Ống nghiệm, đĩa Petri

- Tube Eppendorf 0,2 và 1,5ml - Típ Micropipette

- Găng tay, giấy lau, giấy thấm - Micropipette 0.5 - 1000µl

- Giá đựng ống nghiệm tube Eppendorf 0.2 – 1.5ml - Hộp đựng đầu típ Micropipette

- Bộ kéo, panh - Máy vi tính - Lò vi sóng

2.2.2. Thiết bị dùng trong sinh học phân tử

- Bộ điện di DNA, protein (BIORAD)

- Máy chụp hình gel, hộp đèn soi UV quan sát gel (Uvitec) - Máy điện biến nạp Electroporator 2510 (Eppendorf) - Bể ủ nhiệt khô, ướt

- Máy PCR (Thermo) - Máy ly tâm

- Tủ lạnh 00C chứa mẫu và -800C bảo quản mẫu

- Máy scan gel Hp scanjet 5590

2.2.3. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh

- Cân phân tích - Cân kỹ thuật - pH kế

- Máy cất nước - Nồi hấp

Trần Đức Thụy - Tủ sấy - Tủ cấy - Tủ lạnh 40 C - Lò vi sóng - Hộp đèn soi UV - Máy lắc ổn nhiệt - Máy đo mật độ quang - Máy ly tâm thu sinh khối

2.2.4. Thiết bị dùng cho tinh chế protein

- Máy phá tế bào Transsonic T660/H - Máy ly tâm lạnh falcol

- Máy ly tâm lạnh eppendorf

- Hạt Nikel Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) tinh chế protein dung hợp 6xHis. - Bộ điện di protein

- Máy đo nồng độ protein

2.3. Hóa chất và môi trƣờng2.3.1. Hóa chất 2.3.1. Hóa chất

- Nước cất 1 và 2 lần, ethanol, acetone, HCl 37%, NaOH, NaCl, KCl, Na2HPO4, acid glacial acetic, CaCl2, MgSO4, EDTA, glycin, Tris base, gel agarose, dung dịch gel polyacrylamid 30%, ammonium persunfat, N,N,N’,N’ tetramethylethylene diamine (TEMED), coomassive blue, bromophenol blue, SDS, sarkosyl, trichloroacetic acid (TCA), glycerol, methanol, ethidiumbromide, ampicillin, kanamycin, lysozym

- Dung dịch làm tế bào khả nạp:

 Dung dịch RF1: 1,2% RbCl, 0,98% MnCl2, 30ml Kali acetate 1M, CaCl2.2H2O 1,5g, 116ml glycerol.

Trần Đức Thụy

 Dung dich RF2: 20ml MOPS 0,5M, 1,2g RbCl, 11g CaCl2, 116 ml glycerol.

- Enzym và đệm

 XhoI FastDigest® enzyme + 10X FastDigest buffer (Fermentas)

 HindIII FastDigest® enzyme + 10X FastDigest buffer (Fermentas)

 T4 DNA Ligase 5u/µl +10X T4 DNA Ligase buffer (Fermentas)

 Pfu DNA polymerase 2,5u/µl + 10X Pfu buffer with MgSO4/free Mg2+ (Fermentas)

 Taq DNA polymearase 1unit/µl (Apex) + 10X ammonium buffer (Mg free)

 alkalyn phosphatase + đệm - Dung dịch dùng cho phản ứng PCR

 TE1X dùng pha mồi

 50mM MgCl2

 dNTPs 2,5 mM

 Dung dịch nước khử ion (DW)

- Kit tinh sạch và thu hồi sản phẩm PCR điện di từ gel agarose “illustra GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit” gồm:

 Capture buffer solution (buffer 1): chứa tác nhân acetate và chaotrope làm biến tính protein, hòa tan gel.

 Wash buffer solution (buffer 2): chứa 10mM Tris-HCl pH8,0; 1mM EDTA; ethanol tuyệt đối. Được dùng để rửa cột loại các muối.

 Elution buffer (buffer 3A): chứa 10mM Tris-HCl pH8,0 dung giải DNA

Trần Đức Thụy

- Kit tách chiết plasmid: sử dụng bộ kit tách chiết plasmid “AccuPrep® Plasmid mini Extraction kit” của Bioneer, gồm:

 RNase bổ sung vào buffer 1, cột DNA biding column, cột thu nhận

 Buffer 1: Resuspension buffer for plasmid

 Buffer 2: lysis buffer for plasmid

 Buffer 3: Neutralization buffer for plasmid

 Buffer 4: Washing buffer for plasmid

 Buffer 5: Elution buffer for plasmid

- Kit tạo dòng “TOPO® XL PCR Cloning Kit” của Invitrogen

 Plasmid pCR-XL-TOPO ® dạng thẳng

 50 mM dNTPs

 6X TOPO ® Cloning Stop Solution

 XL Control PCR Template

 XL Control PCR Primers

 M13 Forward Primer

 M13 Reverse Primer

- Kit tinh sạch “TOPO® XL Gel Purification Kit” của Invitrogen gồm:

 Dung dịch Sodium Iodide gồm 6,6M sodium iodide và 16mM sodium sulfite

 Dung dịch Binding buffer gồm 7M Guanidinium HCl

 Dung dịch 1X Final Wash gồm 400 mM NaCl

 TE buffer gồm 10mM Tris-HCl 1mM EDTA, pH8

 Cột thu hồi S.N.A.P Collection Vials

 Cột tinh sạch S.N.A.P Purification Columns

Trần Đức Thụy

 6X Crystal Violet Loading Buffer gồm 30% glycerol, 20mM EDTA, 100µg/ml crystal violet

- Hóa chất tinh chế thu phân đoạn protein

 Đệm PBS 1X

 Đệm STE 1X (Sodium Chloride–Tris–EDTA)

 Sarkosyl 20%

 Dung dịch nhuộm gel coomasive blue (biorad)

 Dung dịch giải nhuộm gel

- Hóa chất xác định đơn vị hoạt độ enzym

 Đệm photphat-citrate (xem phụ lục 4)

 Na2CO31M

2.3.2. Môi trƣờng

S.O.C. Medium (1000ml)

- Lấy 950 ml nước khử ion và thêm vào:

 20,0 g Tryptone

 5,0 g Yeast Extract

 0,5 g NaCl

- Khuấy cho hỗn hợp tan, bổ sung 10ml dung dịch KCl 250 mM. Dùng pH kế đo và chỉnh về 7,0 bằng NaOH 10N. Bổ sung cho đủ 1000ml nước. Hấp khử trùng 1250C/20 phút. Bổ sung 5ml MgCl2 vô khuẩn, để môi trường nguội khoảng 500C bổ sung 20ml glucose 1M.

LB (1000ml)

- Lấy 950 ml nước khử ion và thêm vào:

 Tryptone 10 g

 Yeast Extract 5 g

Trần Đức Thụy

 (Agar 15 g nếu đổ thạch)

- Khuấy hỗn hợp tan, dùng pH kế đo và chỉnh về 7,0 bằng NaOH 10N bổ sung cho đủ 1000ml nước. Hấp khử trùng 1250C/20 phút.

2xYT

- Lấy 950 ml nước khử ion và thêm vào:

 Tryptone 16 g

 Yeast Extract 10 g

 NaCl 5,0 g

- Khuấy cho hỗn hợp tan, dùng pH kế đo và chỉnh về 7,0 bằng NaOH 10N bổ sung cho đủ 1000ml nước. Hấp khử trùng 1250C/20 phút.

2.4. Phƣơng pháp

2.4.1. Thiết kế mồi chuyên biệt

Mồi được thiết kế để khuếch đại đoạn gen lacZ từ vị trí 2634 đến 5690 mã hóa enzym beta-galactosidase hoạt tính trên plasmid pAc5.1/V5-HisB/lacZ. Mồi xuôi F-XhoI-BetaGal gồm 22 nucleotide bổ sung với mạch 3’-5’ của sợi DNA, nucleotide G được thêm vào sau trình tự cắt hạn chế XhoI, bảo đảm sau khi thực hiện phản ứng cắt và nối sản phẩm gen LacZ khuếch đại vào plasmid biểu hiện pTrcHisB sẽ tạo sự đồng khung trong phiên mã protein beta-galactosidase có hoạt tính. Mồi ngược R-HindIII-BetaGal gồm 35 nucleotide, có 23 nucleotide bổ sung với mạch 5’-3’ của sợi DNA. Bộ 3 nucleotide CTA mã hóa stop codon UAG được thêm vào trước 6 nucleotide là vị trí nhận biết của enzym cắt giới hạn Hind III. Một vài nucleotide được thêm vào phía đầu 5’ của hai mồi đảm bảo %GC nhỏ hơn 50% và nhiệt độ nóng chảy của hai mồi gần bằng nhau. Kiểm tra lại mồi bằng thuật toán Oligo Calc (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) và phần mềm DNASTAR version 7.0.0.

Trần Đức Thụy

Để chèn được hai vị trí cắt XhoI và HindIII, chúng tôi đã phải kiểm tra đoạn