Gen LacZ sau khi được tổng hợp, nhờ đặc tính men Taq polymerase nên luôn luôn được thêm nucleotide A ở đầu tận 3’ do vậy nên đoạn LacZ dễ dàng được chèn vào plasmid pCR-XL-TOPO® đã được duỗi thẳng với hai đầu lệch 5’có nucleotide T. Trên plasmid TOPO này, men topoisomerase I được nối đồng hóa trị trên trình tự tận CCCTT của plasmid, và chính nhờ vậy nên một khi đoạn LacZ được chèn vào, phản ứng nối sẽ lập tức xảy ra và năng lượng cho phản ứng nối được cung cấp từ sự bẻ gãy cầu nối phosphodiester giữa phospho với gốc tyrosyl của men topoisomerase I.
Thực hiện điện biến nạp plasmid pCR®
-XL-TOPO®/LacZ này vào vi khuẩn
E.coli Match1TM-T1R. Chọn lọc các dòng tế bào đã biến nạp plasmid tái tổ hợp bằng cách trải các tế bào vi khuẩn này trên môi trường LB-agar có bổ sung kanamycin.
Kết quả sau 14 giờ chúng tôi đã thu được các khuẩn lạc màu trắng của thể biến nạp E.coli Match1TM-T1R có mang plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ kháng
Hình 3.2. Đĩa thạch LB-Kanamycin với các khuẩn lạc E.coli Match1TM-T1R chứa plasmid tái tổ hợp pCR-XL-TOPO®/LacZ sau nuôi cấy 14 giờ.
Trần Đức Thụy
kanamycin, những khuẩn lạc mang plasmid không có gen LacZ sẽ bị chết do trên plasmid này chứa trình tự gen gây chết. (Hình 3.2).
Chọn ngẫu nhiên 10 khuẩn lạc cấy tăng sinh chọn lọc trong LB/ kanamycin. Kết quả sau 14 giờ nuôi cấy ống nghiệm 2, 3, 6, 7, 8, 9 và 10 có môi trường đục, khẳng định kết quả biến nạp thành công plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ vào tế bào
E.coli Match1TM-T1R. (Hình 3.3).
Hình 3.3. Kết quả tăng sinh chọn lọc 10 dòng E.coli Match1TMT1R mang plasmid tái tổ hợp plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ trong LB- Kanamycin.
(Ống nghiêm 1,4,5 không chuyển đục trong khi 7 ống nghiệm còn lại 2,3,6,7,8,9 chuyển đục sau nuôi cấy lắc 370C/14 giờ do chứa plasmid pCR-XL-TOPO®/LacZ có gen kháng kanamycin)
Trần Đức Thụy