Gen LacZ thu được sẽ được nối vào plasmid pTrcHisB bằng enzym ligase, gọi là pTrcHisB-LacZ.
Thực hiện điện biến nạp sản phẩm nối trên vào vi khuẩn E.coli DH5α. Chọn lọc các tế bào đã biến nạp plasmid bằng cách trải các tế bào vi khuẩn này trên môi trường LB-agar có bổ sung ampicillin chúng tôi đã thu được các khuẩn lạc màu trắng của thể biến nạp E.coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ có khả năng kháng ampicillin (Hình 3.9). Các khuẩn lạc này được chọn làm các dòng dự tuyển cho các bước chọn lọc tiếp theo.
Chọn vài khuẩn lạc mọc trên LB-ampicillin tiến hành PCR khuẩn lạc và cấy sao chép đồng thời qua đĩa thạch LB-Ampicillin khác. Chạy điện di kiểm tra các dòng có khuếch đại gen LacZ, với 6 khuẩn lạc cho PCR dương tính chúng tôi tiến hành nuôi tăng sinh chọn lọc trong ống LB bổ sung ampicillin và ly tâm thu sinh khối tế bào và trích biệt plasmid.
Plasmid thu được thu nhận bằng kit “AccuPrep® Plasmid mini Extraction kit” của Bioneer. Và chạy điện di trên gel agarose 0,8% kiểm tra kích thước plasmid thu được.
Hình 3.9. Kết quả điện biến nạp, khuẩn lạc pTrcHisB-LacZ
mang gene kháng ampicillin mọc trên LB-Amp sau 14 giờ nuôi cấy
Trần Đức Thụy
Kết quả điện di cho thấy vạch rõ ràng, như vậy chúng tôi thu được 6 dòng plasmid pTrcHisB-LacZ có kích thước khoảng 7,5kb. (Hình 3.10).
Chọn dòng số 4 và tiến hành kiểm tra plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ bằng cắt giới hạn, sử dụng enzym cắt giới hạn XhoI và HindIII. Chạy điện di trên gel agarose 0,8% cho thấy kết quả có hai vạch có kích thước khoảng 3,1kb tương ứng với gen LacZ (giếng 1 và 2) và vạch có kích thước 4,4kb tương ứng với plasmid pTrcHisB ở dạng thẳng. (Hình 3.11). Như vậy có sự hiện diện gen LacZ trong plasmid pTrcHisB/LacZ
7,5k b 2,0k b
Hình 3.10. Kết quả trích biệt thu 6 dòng
plasmid pTrcHisB-LacZ
(giếng 1 thang chuẩn DNA 500bp; giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7 plasmid pTrcHisB-LacZ).
Trần Đức Thụy
Như vậy chúng tôi đã thành công tạo dòng E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pTrcHisB-LacZ. Plasmid pTrcHisB-LacZ được giải trình tự với cặp mồi F- XhoI-BetaGal để phân tích trình tự gen và độ đồng khung.
Do việc giải trình tự được dùng với mồi xuôi F-XhoI-BetaGal nên phần kết quả những nucleotide đầu không thấy, tuy nhiên dựa vào những nucleotide thấy được từ mồi chúng tôi khẳng định gen LacZ có độ đồng khung 100% so với trình tự gốc trên plasmid pAc5.1/V5-HisB/LacZ. (Hình 3.12).
LacZ
2,0kb
4,0kb 3,0kb
Hình 3.11. Kết quả cắt giới hạn plasmid pTrcHisB-LacZ với enzym XhoI
và HindIII cho hai vạch đúng như dự đoán là 3,1kb và 4,4kb. (Giếng 1, gene LacZ (chứng +); 2, plasmid tái tổ hợp pTrcHisB/LacZ xử lý bằng XhoI và HindIII; 3, plasmid tái tổ hợp pTrcHisB/LacZ dòng số 4; 4, Thang chuẩn DNA 500bp)
Trần Đức Thụy