EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng của các chủng Việt Nam và Thế giới
Vị trí acid amin số 487 được sử dụng để so sánh đối chiếu EBNA-1 của 4 mẫu EBV thu nhận từ bệnh nhân NPC nhập viện tại Hà Nội (EB17, EB18, EB19, EB20) và một số chủng Việt Nam mới thu nhận gần đây là chủng HP6 (Hải Phòng); chủng EB9 (Hà Nội) đại diện bệnh nhân nhập viện tại miền Bắc và chủng MT7 (Miền Trung) đại diện miền Trung. Một số chủng quốc tế được so sánh, đặc biệt là chủng cổ điển B95-8 (1) và B95-8 (2) được sử dụng để phân biệt prototype; chủng C18, GD1 và HHV (Trung Quốc) đại diện Nam Trung Quốc của châu Á và chủng AG876 (Ghana) đại diện EBV týp 1 và châu Phi. (Hình 3.13).
Kết quả so sánh trình bày ở Hình 3.13 cho thấy, tại vị trí số 487, 4 chủng EBV của Hà Nội chứa 1 loại acid amin, đó là V (valine), từ đó xác định thuộc phân týp: V-val (Variant valine).
Kết quả xác định phân týp của 13 chủng, bao gồm cả 4 chủng nghiên cứu và 9 chủng tham chiếu của Việt Nam và thế giới được liệt kê ở Bảng 3.4. Bảng 3.4 cũng cho thấy chi tiết, cả 4 mẫu nghiên cứu thuộc V-val (EB17, EB18, EB19, EB20); mẫu EB9 (Hà Nội) thuộc V-val; mẫu Miền trung thuộc P-thr (MT7); mẫu Hải Phòng thuộc mẫu P-ala (HP6); 3 mẫu đại diện Nam Trung Quốc: mẫu C18 thuộc P-thr, GD1 thuộc V-val và mẫu HHV thuộc P-ala; 2 chủng cổ điển B95-8 (1) và B95-8 (2) thuộc P-ala; chủng AG876 (Ghana) đại diện EBV týp 1 thuộc V-leu
Hình 3.13. So sánh một phần trình tự acid amin EBNA-1 của 13 chủng nghiên cứu, gồm 4 chủng đang nghiên cứu là EB17; EB18; EB 19; EB20; chủng EB9 của Hà Nội, chủng MT7 của miền trung và chủng HP6 của Hải Phòng. 2 biến thể của chủng cổ điển B95-8; chủng AG876 và 3 chủng của Trung Quốc (HHV, GD1 và C18). Vị trí aa 487 được chỉ dẫn bằng mũi tên; aa ở vị trí số 487 của các chủng EBV so sánh được đóng khung dọc.`
Bảng 3.4. Kết quả xác định phân týp của các chủng EBV qua phân tích acid amin tại vị trí số 487 của EBNA-1
TT Chủng Năm phân lập aa 487 Kết quả xác
định phân týp
1 EB17- EBNA-1 2000 V V-val
aa 487
* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 EB17-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 EB18-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 EB19-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 EB20-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 EB9-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 MT7-EBNA1 : PFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDMPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNQKFENIAEGLRTLLARCHVERTTDEGTWVAGVF : 105 HP6-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGHGGSNQKFENIAEGIKALLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 AG 876-EBN : PFFHPVAEADYFEYHQEGGPDGEPDMPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWYGKHRGEGGSSQKFENIAEGLRLLLARCHVERTTEDGNWVAGVF : 105 B95-8(1)-E : PFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF : 105 B95-8(2)-E : PFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF : 105 HHV-EBNA1 : PFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF : 105 GD1-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 C18-EBNA1 : ----PVGQADYFEYHQEGGPDGEPDMPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNQKFENIADGLRTLLARCHVERTTDEGTWVAGVF : 101
2 EB18- EBNA-1 2000 V V-val
3 EB19- EBNA-1 2000 V V-val
4 EB20- EBNA-1 2000 V V-val
5 EB9- EBNA-1 2000 V V-val
6 MT7- EBNA-1 2009 T P-thr
7 HP6- EBNA-1 2009 A P-ala
8 AG876- EBNA-1 2007 L V-leu 9 B95-8 (1)-EBNA-1 2006 A P-ala 10 B95-8 (2)-EBNA-1 1996 A P-ala
11 HHV- EBNA-1 2006 A P-ala
12 GD1- EBNA-1 2005 V V-val
13 C18 – EBNA-1 2004 T P-thr
Kết quả xác định acid amin vị trí aa số 487 của 4 chủng EBV Hà Nội cho thấy đều thuộc phân týp V-val; các mẫu này được phân lập năm 2000. Theo nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Hòa và cs (2010), có khi phân tích 22 mẫu nghiên cứu thu thập các năm 2000 và gần đây (2008-2009), 14 mẫu có phân týp V-val; trong đó tất cả các mẫu năm 2000 đều thuộc phân týp V-val [10]. Như vậy cho đến nay, chưa phát hiện phân týp khác ngoài V-val ở các mẫu NPC thu nhận trước năm 2000. Một điều lưu ý là EBV có đặc tính đa hình biến đổi giữa các chủng phân lập ở các vùng địa lý thuộc Nam và Đông Nam châu Á [68] và nghiên cứu của Mai et al [43], [44] chứng minh các chủng EBV thuộc V-val ở vùng Nam Trung Quốc, có khả năng tăng cường sao chép và có vai trò quan trọng trong tiến triển NPC. Xác định được phân týp (V-val) trong số mẫu EBV chúng tôi nghiên cứu (EB17, EB18, EB19, EB20) và so sánh (EB9) của Hà Nội, giúp chúng tôi khẳng định các mẫu nghiên cứu năm 2000 đều thuộc V-val, còn các mẫu MT7, HP6 năm 2009 xuất hiện thuộc P-ala và P-thr và các chủng so sánh khác của thế giới thuộc V-leu, P-ala và P-thr . Tuy số mẫu chưa nhiều, nhưng nghiên cứu của chúng tôi cho thấy EBV Việt Nam, về mặt dịch tễ học, có bị ảnh hưởng của vệt dịch tễ EBV từ Quảng Đông - Nam Trung Quốc tới Đông Nam châu Á.
Thảo luận chung
- Với kết quả thu được, trên cơ sở trình tự nucleotide và acid amin của HPV-16 và HPV-18 là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC ở các mẫu bệnh phẩm làm đối tượng nghiên cứu thu nhận tại Hà Nội. Mối liên quan giữa loại/týp HPV-16 và HPV-18 đã được xác định và bệnh ung thư CTC ở một số bệnh nhân tại Hà Nội, bước đầu tìm hiểu chính xác nguyên nhân gây bệnh này ở bệnh nhân phụ nữ. Trên cơ sở bước đầu phát hiện HPV-16/HPV-18 bằng phương pháp đa mồi multiplex-PCR chúng ta xây dựng phương pháp chẩn đoán phân tử dựa trên phản ứng PCR nhằm hỗ trợ các phương pháp chẩn đoán tế bào và mô bệnh học.
- Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử các chủng EBV của Việt Nam thu nhận dữ liệu từ gen EBNA-1 (gen gây ung thư giai đoạn sớm) trong báo cáo phân tích là một sản phẩm có ý nghĩa quốc gia và quốc tế, đặc biệt về virus EBV của vùng châu Á có xu hướng gây sơ nhiễm, nhiễm tiềm tàng, tái hoạt gây tiến triển NPC. Các trình tự gen của chúng tôi thu nhận là gen EBNA-1 của của chủng EBV đang nghiên cứu. Điều này cũng khẳng định toàn bộ quá trình kĩ thuật, nhằm thu nhận gen EBNA-1 của EBV, được chúng tôi thực hiện là hoàn toàn tin cậy. Xác định được phân týp (V-val) trong số mẫu EBV chúng tôi nghiên cứu (EB17, EB18, EB19, EB20) và so sánh (EB9) của Hà Nội, giúp chúng tôi khẳng định các mẫu nghiên cứu năm 2000 đều thuộc V-val, còn các mẫu MT7, HP6 năm 2009 xuất hiện thuộc P-ala và P-thr và các chủng so sánh khác của thế giới thuộc V-leu, P-ala và P-thr. Tuy số mẫu chưa nhiều, nhưng nghiên cứu của chúng tôi cho thấy EBV Việt Nam, về mặt dịch tễ học, có bị ảnh hưởng của vệt dịch tễ EBV từ Quảng Đông - Nam Trung Quốc tới Đông Nam châu Á là cơ sở cho việc xây dựng phương pháp chuẩn đoán nhanh bằng kỹ thuật PCR.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả phân tích và bàn luận ở trên, chúng tôi rút ra một số kết luận chính như sau:
1. Trình tự gen E6 có kích thước 321 bp, gen L1 có kích thước 556 bp, trong
số các mẫu nghiên cứu PK10, PK11, PK12, PS16 đã được thu nhận và phân tích. Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex-PCR trên 4 mẫu HPV nghiên cứu là các mẫu song nhiễm cả hai týp HPV-16 và HPV-18.
2. Thực hiện thành công phản ứng Multiplex-PCR phát hiện HPV16/HPV18
trên 11 mẫu nghiên cứu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Trình tự gen EBNA-1 của các mẫu EB17, EB18, EB19, EB20 có kích
thước khoảng 800 bp phân lập tại Hà Nội đã được thu nhận và phân tích.
4. Xác định được phân týp (V-val) trong số mẫu EBV (EB17, EB18, EB19,
EB20) và so sánh (EB9) của Hà Nội, giúp chúng tôi khẳng định các mẫu nghiên cứu năm 2000 đều thuộc V-val, còn các mẫu MT7, HP6 năm 2009 xuất hiện thuộc P-ala và P-thr và các chủng so sánh khác của thế giới thuộc V-leu, P-ala và P-thr.
2. KIẾN NGHỊ
Tiếp tục thu nhận, giải trình tự các mẫu bệnh phẩm bệnh nhân EBV và HPV nhằm thu được dữ liệu sinh học phân tử gen EBNA-1 của chủng EBV và hai gen E6 của chủng HPV-16 và L1 của chủng HPV-18, làm cơ sở cho chẩn đoán, giám định phân loại và xây dựng phương pháp chuẩn đoán nhanh các mẫu bệnh phẩm chủng EBV và HPV.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Phạm Thị Hoàng Anh, Nguyễn Mạnh Quốc, Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Chấn
Hùng (2001), “Tình hình bệnh ung thư ở Việt Nam năm 2000”, Tạp chí thông tin Y dược 2/2001, Bộ Y tế - Viện thông tin Y học Trung ương, tr. 3- 11.
2. Bộ môn Vi Sinh (2001), Vi Sinh Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 386.
3. Trịnh Quang Diện (1995), Phát hiện các dị sản, loạn sản và ung thư cổ tử
cung bằng phương phát tế bào học, Luận án Tiến sỹ Y học, Trường Đại học
Y Hà Nội.
4. Trịnh Quang Diện (2002), Theo dõi bằng tế bào học và mô bệnh học các tế
bào bào vẩy không điển hình ý nghĩa chưa xác định (ASCUS) gặp trong
phát hiện tế học các tổn thương nội biểu mô và ung thư cổ tử cung, Chuyên
đề ung thư học, Y học thực hành, Nhà xuất bản Y học, số 431, tr. 266- 269.
5. Đào Trung Dũng (2003), Chẩn đoán tế bào học ASCUS trong phát hiện
sớm ung thư cổ tử cung, Luận văn Bác sỹ Y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội.
6. Phan Trường Duyệt, Đinh Thế Mỹ (2003), Lâm sàng sản phụ khoa, Nhà
xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 444- 448.
7. Nguyễn Văn Đô, Phan Thị Phi Phi (2003), Xác định đột biến mất đoạn 30bp và đột biến điểm của gen EBV-LMP ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Việt Nam, Hội nghị sinh học phân tử và hoá sinh toàn quốc, tr. 129-134.
8. Phạm Thị Hồng Hà (2000), Giá trị của phiến đồ âm đạo - cổ tử cung, soi cổ
tử cung và mô bệnh học trong việc phát hiện sớm ung thư cổ tử cung, Luận
văn Thạc sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
9. Lê Thanh Hoà (2006), Y - Sinh học phân tử, Quyển I, Nhà xuất bản y học,
Hà Nội, tr. 64- 85.
10. Lê Thanh Hòa, Vũ Thị Tiến, Hoàng Thị Minh Châu, Lê Thanh Hà, Nguyễn
Đình Phúc (2010), Xác định 3 phân typP-ala, P-thr và V-val của EBNA-1 ở EBV phân lập tại Việt Nam, Tạp chí Nghiên cứu Y học 70(5), tr. 8-12.
11.Vương Tiến Hoà (2004), Một số vấn đề bệnh lý cổ tử cung, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12.Trần Phương Mai (1999), Nhận xét 89 trường hợp ung thư cổ tử cung tại
Viện BVBM TSS trong 6 năm (1992- 1997), Tạp chí Y học thực hành số
1/1999, tr. 37- 39.
13.Phan Thị Phi Phi (2005), Báo cáo tổng quan các đặc điểm sinh học chủ yếu
gặp ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Việt Nam và một số ứng dụng lâm sàng. Hội thảo chuyên đề ung thư vòm mũi họng, Hà Nội (07-09.11.2005).
14.Nguyễn Đình Phúc (2006), “Nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng và gen virus
Epstein – Barr trong ung thư vòm mũi họng’’, Luận án TS khoa học Y học
– ĐHYHN.
15.Nguyễn Quốc Trực, Lê Văn Xuân (2000), Chẩn đoán và điều trị các thương
tổn tiền ung thư cổ tử cung, Tạp chí thông tin Y - Dược 8/2000, Viện thông
tin Y học Trung ương, tr. 220- 224.
Tiếng Anh
16.Apt D, Watts RM, Suske G, U Bernard U (1996), “High Sp1/Sp3 ratios in
epithelial cells during epithelial differentiation and cellular transcription correlate with the activation of the HPV-16 promoter”, Virology, 224,
pp. 281– 291.
17.Bosch F, Manos MM, Munoz N, Sherman M, Jansen AM, Peto J,
Schiffman M H, Moreno V, Kurman R, Shah KV, International Biological Study on Cervical Cancer (IBSCC) Study Group (1995), “Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective”,J. Natl.
Cancer Inst, 87, pp. 796–802.
18.Bosch FX, Munoz N (2002), “The viral etiology of cervical cancer”, Virus
Res. 89, pp. 183-190.
19.Bosch FX, Lorincz A, Munoz N, Meijer CJ, Shah KV (2002), “The causal
relation between human papillomavirus and cervical cancer”, J. Clin.
20.Chan AT, Teo PM, Huang DP (2004), Pathogenesis and treatment of nasopharyngeal carcinoma. Semin Oncology, 31(6), pp. 794-801.
21.Chan SY, Bernard HU, Ratterree M, Birkebak TA, Faras AJ, Ostrow RS
(1997), “Genomic diversity and evolution of papillomaviruses in rhesus monkeys”, J. Virol. 71, pp. 4938- 4943.
22.Chan SY, Delius H, Halpern AL, Bernard HU (1995), “Analysis of genomic
sequences of 95 papillomavirus types: uniting typing, phylogeny, and taxonomy”, J. Virol. 69, pp. 3074-3083.
23.Chang ET, Adami HO, (2006), The enigmatic epidemiology of
nasopharyngeal carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 15(10),
pp. 1765-77, Review. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
24.Chou J, Lin YC, Kim J, You L, Xu Z, He B, Jablons DM (2008),.
Nasopharyngeal carcinoma-Review of the molecular mechanisms of tumorigenesis. Head Neck. 2008 Apr 29.
25.Clifford GM, Smith JS, Plummer M, Munoz N, Franceschi S (2003),
Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta- analysis, Br. J. Cancer 88, pp. 63-73.
26.Cohen JI (2006), Virology and molecular biology of Epstein-Barr virus. In
“Epstein-Barr Virus”, Edited by Tselis A and Jenson HB.Taylor and Francis Group LLC, New York NY, pp. 21-37.
27.Denny L, Ngan HYS (2006), Malignant manifes-tations of HPV infection:
Carcinoma of the cervix, vulva, vagina, anus, and penis. International
Journal of Gynecology and Obstetrics. 2006; 94(Suppl 1), pp. S50–S55.
28.Epstein MA, Barr YM, Achong BG (1964), Virus particles in cultured
lymphoblasts from Burkitt’s lymphoma, Lancet 15, pp. 702-703.
29.Gulley ML (2001), Molecular Diagnosis of Epstein-Barr Virus-Related
Diseases, J Mol Diag 3(1), pp. 1-10.
30.Guo XC, Scott K, Liu Y, Dean M, David V, Nelson GW, Johnson RC,
H, Zheng Y, de The G, Liao J, Zeng Y, O'Brien SJ, Winkler CA. (2006), Genetic factors leading to chronic Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma in South East China: study design, methods and feasibility, Hum Genomics, 2(6), pp. 365-75.
31.Hiraki A, Fujii N, Masuda K, Ikeda K, Tanimoto M, (2001), Genetics of
Epstein-Barr virus infection, Biomed Pharmacother. 55(7), pp. 369-72,
Review.
32.Howley PM (1995), “Papillomavirinae: The Viruses and Their
Replication”, In Fields Virology Lippincott-Raven, Philadelphia, pp. 2045-2076.
33.Ke X, Yang YC, Hong SL, (2010), EBV-LMP1-targeted DNAzyme
restrains nasopharyngeal carcinoma growth in a mouse C666-1 xenograft model.. PMID: 20862567, Abstract.
34.Klein U, Klein G, Ehlin-Henriksson B, Rajewsky K, Kuppers R (1995), Burkitt’s lymphoma is a malignancy of mature B cells expressing somatically multated V-region genes, Mol, Med, 1, pp. 495-505.
35.Kumar S, Tamura K, Jakobsen IB & Nei M (2001), “MEGA2: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis software”, Arizona State University,
Tempe, Arizona, USA.
36.Laderman EI, Whitworth E, Dumaual E, Jones M, Hudak A, Hogrefe W,
Carney J, Groen J. (2008), Rapid, sensitive, and specific lateral-flow immunochromatographic point-of-care device for detection of herpes simplex virus type 2-specific immunoglobulin G antibodies in serum and whole blood. Clin Vaccine Immunol, 15(1), pp. 159-63.
37.Lee YC, Hwang YC, Chen KC, Lin YS, Huang DY, Huang TW, Kao CY,
Wu HC, Lin CT, Huang CY, (2007), Effect of Epstein-Barr virus infection (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
on global gene expression in nasopharyngeal carcinoma, Funct Integr
Genomics, 7(1), pp. 79-93.
38.Lin JC, Cherng JM, Lin HJ, Tsang CW, Liu YX, Lee SP, (2004), Amino acid changes in functional domains of latent membrane protein 1 of
Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma of southern China and Taiwan: prevalence of an HLA A2-restricted 'epitope-loss variant', J Gen
Virol. 85(7), pp. 2023-34.
39.Lin JC, Wang WY, Liang WM, Chou HY, Jan JS, Jiang RS, Wang JY, Twu
CW, Liang KL, Chao J, Shen WC, (2007), Long-term prognostic effects of plasma epstein-barr virus DNA by minor groove binder-probe real-time quantitative PCR on nasopharyngeal carcinoma patients receiving concurrent chemoradiotherapy, Int J Radiat Oncol Biol Phys, 68(5), pp. 1342-8.
40.Liu JP, Cassar L, Pinto A, Li H, (2006), Mechanisms of cell
immortalization mediated by EB viral activation of telomerase in nasopharyngeal carcinoma. Cell Res, 16(10), pp. 809-17, Review.
41.Lo KW, Huang DP (2002), Genetic and epigenetic changes in
nasopharyngeal carcinoma, Semin Cancer Biol, 12(6), pp. 451-62, Review.
42.Lowy DR, Kirnbauer R, Schiller JT (1994), Genital human papillomavirus