phƣơng pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thƣ vòm mũi họng ở Việt Nam
Khi người bị nhiễm EBV có những điều kiện cần thiết cho sự tiến triển ung thư VMH và nhiễm tiềm tàng EBV vào tế bào lympho-B đủ điều kiện phát triển thành dạng ung thư Burkitt (BL), người ta luôn thấy gen EBNA-1 ở trạng thái sao chép sớm và protein luôn luôn được tổng hợp, do vậy kháng nguyên EBNA-1 xuất hiện kèm theo cho phép xác nhận tế bào đã chuẩn bị cho sự chuyển dạng sớm trở thành ung thư. Việc phát hiện gen EBNA-1 trong những tháng đầu tiên, đặc biệt là phát hiện từ tế bào lympho-B chuyển dạng có tầm quan trọng đặc biệt cho sự xác nhận chính xác bệnh nhân đã có dấu hiệu ung thư sớm [58]. VCA (Viral capsid antigen) là kháng nguyên vỏ virus, luôn luôn xuất hiện trong người nhiễm EBV, vì
EBV nhân lên trong tế bào biểu mô cần protein này. Đối với EBV gây nhiễm tiềm tàng lympho-B và có dấu hiệu chuyển dạng gây ung thư hay biểu mô vùng họng chuyển thành NPC, sự biểu hiện gen EBNA nói chung và EBNA-1 nói riêng cũng như thành phẩm của gen này là protein EBNA-1 trong cơ thể là chỉ thị chẩn đoán hết sức quan trọng và cần thiết xác định người bệnh xuất hiện ung thư ở giai đoạn sớm. EBNA-1 cần thiết cho virus nhân lên và khép vòng tạo episome chuẩn bị cho sự gây nhiễm tiềm tàng và chuyển dạng ung thư, do vậy, gen EBNA-1 có giá trị chẩn đoạn sớm rất cao trong ứng dụng sinh học phân tử.
Chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật PCR thông thường và PCR định lượng (real-time PCR) đã được áp dụng rộng rãi đối với phát hiện EBV ở mọi dạng gây nhiễm và gây bệnh, ở ung thư NPC hay Burkitt hoặc trong các ung thư khác có liên quan đến vai trò của EBV [29]. Một số nghiên cứu sử dụng PCR và real-time PCR đã thành công trong phát hiện EBV ở ung thư vú, trong liên kết tiến triển NPC [39], trong tế bào di căn lan toả trong cơ thể hoặc sử dụng phát hiện gen trước khi kiểm nghiệm bằng huyết thanh học và PCR còn phát hiện được EBV trong bệnh phẩm cố định paraffin hoặc mẫu máu lâm sang [38]. Như vậy, có thể phân làm 2 giai đoạn chẩn đoán: chẩn đoán sớm (trong vòng 6 tháng) sử dụng kỹ thuật phân tử phát hiện gen EBNA-1 hoặc kỹ thuật miễn dịch phát hiện sản phẩm của gen và chẩn đoán muộn kỹ thuật miễn dịch phát hiện kháng thể kháng EBNA-1.
Tuy nhiên, cho đến nay những nghiên cứu sinh học phân tử EBV và NPC ở nước ta mới chỉ dừng ở góc độ khám phá chỉ thị di truyền phân tử giúp giám sát lâm sàng chứ chưa có những nghiên cứu gen/hệ gen một cách có hệ thống để có
những giám sát dịch tễ học phân tử loại virus nguy hiểm này. Vì thế, việc chẩn
đoán sớm và phòng bệnh còn rất hạn chế. Hiện nay, phương pháp PCR sử dụng chỉ thị phân tử của EBV, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hơn nữa có thể xác định được các týp EBV đã và đang được ứng dụng vào trong chẩn đoán. Các dữ liệu về gen và hệ gen của EBV được lưu trữ trong Ngân hàng Gen [GenBank - (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)] là một nguồn dữ liệu giá trị cho việc phân tích,
so sánh đối chiếu các týp EBV ở Việt Nam, qua đó lựa chọn ra các chỉ thị di truyền của EBV nhằm phục vụ cho xây dựng phương pháp chuẩn đoán nhanh bằng kỹ thuật PCR phát hiện EBV lưu hành gây bệnh tại Việt Nam, giúp cho việc chẩn đoán phát hiện sớm EBV, bước đầu định hướng ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong việc chẩn đoán ung thư vòm họng và xác định týp EBV hay gặp ở nước ta.
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Bệnh phẩm lấy từ dịch cổ tử cung của bệnh nhân, đã được chẩn đoán ung thư cổ tử cung (Pap smear dương tính) tại Bệnh viện phụ sản Hà nội
Mẫu mô lấy từ bệnh nhân có biểu hiện ung thư vòm mũi họng qua kiểm tra tế bào tại Bệnh viện Tai mũi họng Trung ương – Hà Nội.
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị
Máy PCR (MJ Thermocycler, USA); Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI-3100 Avant Genetic Analyzer, Perkin Elmer Inc., USA); Tủ lạnh sâu -
200C và -700C (Nhật Bản); Lò vi sóng (Sam sung); Máy lắc ổn nhiệt 370
C; Máy khuấy từ; Máy làm khô và hút chân không (Speed-Vac); Máy ly tâm lạnh và ly tâm để bàn (Eppendorf); Máy khuấy trộn Vortex (Bio- Rad); Bộ điện di DNA và bộ nguồn điện di (Bio- Rad); Máy soi gel và chụp ảnh tự động (Dolphin- Doc, WEALTEC, USA); Tủ cấy vô trùng (Nhật Bản); Pipet man các loại và các dụng cụ
thuỷ tinh khác; Dụng cụ phải được vô trùng tuyệt đối (Hấp ướt 1200
C trong 20 phút).
2.2.2. Hoá chất
Hoá chất gồm: Yeast Extract (DIFCO, Mỹ), Bacto- pepton (DIFCO, Mỹ), EDTA (Sigma, Mỹ), SDS, Tris, EDTA (Sigma, Mỹ), dNTP (Promega, Mỹ), Xgal (Sigma, Mỹ), IPTG (Roth, Đức), Ampicillin, Kanamycin (Merk, Đức)....
Kít sử dụng tách DNA tổng số, kít tinh sạch DNA, bộ kít tách chiết plasmid BIONEER, (Hàn Quốc). Bộ kít dòng hóa sản phẩm PCR (Invitrogen Inc.).
Các loại enzym giới hạn (EcoRI; T4-DNA ligase...) của hãng New
England Biolabs và Invitrogen Inc. Tất cả các hoá chất này được sử dụng và bảo quản theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và được trình bày cụ thể ở mục quy trình và kỹ thuật nghiên cứu.
Các mồi để chạy PCR và sequencing được đặt tổng hợp tại Genset Pty. Ltd., Lismor, NSW, Australia
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân tích gen EBNA-1 của EBV, gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 từ mẫu bệnh phẩm thu được ở trên bằng hai lĩnh vực kĩ thuật chính:
- Kĩ thuật sinh học phân tử (molecular cloning): Phân lập gen EBNA-1 của EBV, gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 từ mẫu bệnh phẩm.
- Các chương trình tin – sinh học (bioinformatics): Thu nhận và phân tích các đặc tính sinh học (đột biến thành phần nucleotide và acid amin, các đột biến cấu trúc). Xác định tính tương đồng, gen EBNA-1 của EBV, gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 thu nhận từ mẫu bệnh phẩm trên với chuỗi gen EBNA-1, E6 và L1 các chủng EBNA-1, E6 và L1 của thế giới. Quy trình nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1.
TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU BỆNH PHẨM
(Sử dụng bộ AccuPrep™ Genomic DNA Extraction Kit(BIONEER, Hàn Quốc))
THỰC HIỆN CHUỖI PHẢN ỨNG PCR
(Virus HPV cặp mồi (E6F - E6R và HP18F – HP18R) và Virus EBV cặp mồi (EBK1F - EBVR) )
DÒNG HOÁ DNA SẢN PHẨM PCR (SỬ DỤNG VECTOR pCR2.1 TOPO) VÀ THU NHẬN DNA SẢN PHẨM DÒNG HOÁ
GIẢI TRÌNH TỰ
XỬ LÝ VÀ THU NHẬN CHUỖI GEN EBNA1 VÀ E6, L1 (Thành phần trình tự Nucleotide)
SO SÁNH PHÂN TÍCH CHUỖI GEN EBV VÀ HPV-16/ HPV-18 VỚI CÁC CHỦNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
TINH SẠCH SẢN PHẨM
2.4. Quy trình nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh chuỗi nucleotid trong một phân đoạn DNA của hệ gen là một quá trình nhiều giai đoạn: chuẩn bị các nguyên liệu DNA tổng số làm khuôn, các thành phần nguyên liệu và quy trình cho phản ứng PCR, quá trình kiểm tra tinh sạch và tạo dòng sản phẩm, quá trình tách chiết và xử lý các plasmid tái tổ hợp, quá trình giải trình tự và xử lý chuỗi nucleotid và ứng dụng
các chương trình sinh - tin học (bioinformatics) xem xét, so sánh đối chiếu và
tìm kiếm hiệu quả của chuỗi nucleotid vừa thu nhận được.
2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản
- Cách lấy mẫu:
1. Sử dụng tăm bông hoặc que quệt bẹt (Ayre), cách lấy mẫu giống như
làm phiến đồ Pap smear, phết dịch niêm mạc CTC trên lam kính. Tổng số gồm
04 mẫu ký hiệu PK10, PK11, PK12 và PS16 thu tại Hà Nội. Mẫu thu được để khô tự nhiên. Sau đó, cho vào một hộp giấy sạch và được đưa về phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học, bảo đảm an toàn sinh học cao. Bảo quản ở
-200C (tủ lạnh âm sâu) cho đến khi tiến hành tách mẫu.
2. Các bệnh viện tại Hà Nội chuyên khoa tai - mũi - họng xét nghiệm bệnh nhân, thu mẫu mô có biểu hiện NPC qua kiểm tra tế bào. Mẫu mô ở dạng
tươi, bảo quản ở -200
C.Những mẫu được chẩn đoán có tế bào ung thư sẽ được
giữ lại và bảo quản trong cồn 70%/epp 1,5ml. Ngay sau đó, cho mẫu vào đá lạnh và đưa về phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học. Bảo quản ở -
200C (tủ lạnh âm) cho đến khi tiến hành tách DNA tổng số virus.
2.4.2. Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số
Virus lây nhiễm tồn tại trong tế bào của bệnh phẩm, nên muốn tách được hệ gen của virus, chúng ta có thể tiến hành tách toàn bộ DNA có trong tế bào, trong đó có DNA của hệ gen virus (nếu tế bào nhiễm EBV và HPV); DNA của nhân tế bào chủ (tế bào người) và của hệ gen ty thể; RNA các loại (nếu không
dùng enzym phá hủy RNA) và có thể có RNA khác. Toàn bộ DNA tách được được gọi là DNA tổng số hay DNA toàn bộ (DNA hỗn hợp) (total genomic DNA). Quy trình tách chiết DNA tổng số sử dụng AccuPrep™ Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Hàn Quốc) được mô tả tóm tắt như sau: mẫu bảo quản -
200C được lấy ra và để ở nhiệt độ phòng cho tan. Mẫu vật được nghiền kỹ và xử
lý với các dung môi của kít, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết DNA theo qui trình tách chiết của hãng. Cụ thể các bước như sau:
1. Cho bệnh phẩm vào ống Eppendorf sạch. Cho tiếp 20 l Proteinase K và
thêm 180l Buffer ATL, trộn đều. ủ ở 560C trong 3 giờ.
2. Thêm 4 l RNAase và 200 l Buffer AL. Ủ ở 700C trong 30 phút. Thêm
200l Ethanol (96- 100%), trộn đều.
3. Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Loại bỏ dịch dưới.
4. Thêm 500 l Buffer AW1, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch
dưới.
5. Thêm 500 l Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch
dưới. Tiếp tục ly tâm thêm một lần nữa như trên.
6. Chuyển cột lọc đã giữ lại DNA hệ gen của virus trong màng lọc sang
ống Eppendorf loại 1,5 ml. Thêm 100 l Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, đó là DNA tổng số trong đó có hệ gen DNA của virus HPV.
Ký hiệu mẫu, bảo quản ở -200
C.
DNA tổng số tách chiết ra được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 0,8%. Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút. Chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel Dolphin-Doc (WEALTEC, USA).
2.4.3 Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR 2.4.3.1 Thiết kế mồi 2.4.3.1 Thiết kế mồi
Dùng phương pháp truy cập Ngân hàng gen [GenBank (http://www. ncbi.nlm.nih.gov)], để tìm kiếm tất cả các chuỗi nucleotid hiện có của tất cả các
chủng/týp thuộc họ Papillomavirus và Epstein-Barr Virus đã được đăng ký cho
đến hiện nay.
Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR:
- Thiết kế cặp mồi cho gen E6 của HPV-16 chúng tôi chọn cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn DNA vùng "siêu biến đổi" thuộc gen E6 bằng phản ứng PCR, dựa trên cơ sở các trình tự bảo tồn của gen E6, gồm mồi xuôi E6F và mồi ngược E6R.
E6F: 5-CAAGCAACAGTTACTGCGA-3
E6R: 5-CAACAAGACATACATCGACC-3.
Sản phẩm PCR thu được có độ dài là 321 bp.
- Thiết kế cặp mồi cho HPV-18 chúng tôi đã chọn cặp mồi (primer) đặc
hiệu để nhân bản DNA đích của HPV-18 bằng phản ứng PCR dựa trên cơ sở các trình tự bảo tồn của gen L1, gồm mồi xuôi HP18F và mồi ngược HP18R. Trình tự cặp mồi cho HPV-18 là:
HP18F: 5'- AGGCACAGGGTCATAACAATGG -3'; HP18R: 5'- CGCTTGGCAGGTTTAGAAGACG -3'. Sản phẩm PCR thu được có độ dài là 556 bp.
- Thiết kế cặp mồi cho EBNA-1 chúng tôi đã chọn cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn DNA gen EBNA-1 có vai trò chủ đạo trong chu kỳ tái tạo, nhân lên và gây bệnh của EBV. Các trình tự tương ứng với đoạn DNA nghiên cứu từ
một số chủng/týp thuộc Epstein-Barr Virus đã được đăng ký tại Ngân hàng Gen
vùng nói trên được nhân lên bằng phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi (primer pairs) bám vào gen EBNA-1, như sau:
EBK1F: 5’-GTCATCATCATCCGGGTCTC-3’ EBV1R: 5’ -CGATTGAGGGCGTCTCCTAAC- 3’
Sản phẩm PCR thu nhận đoạn gen EBNA-1 có độ dài khoảng 800 bp.
2.4.3.2 Quy trình phản ứng PCR
DNA tổng số thu được được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, với
hàm lượng DNA sử dụng cho mỗi phản ứng PCR (dung tích 50 l) là khoảng
100-150 nanogam (ng).
Với cặp mồi E6F - E6R, đoạn DNA nhân lên bằng PCR có độ dài 321 bp, với đối tượng nhân lên trong phản ứng PCR là đoạn gen E6 của HPV-16. Với cặp mồi HP18F- HP18R, đoạn DNA nhân lên bằng PCR có độ dài 556 bp, với đối tượng nhân lên trong phản ứng PCR là đoạn gen L1 của HPV-18. Hai cặp mồi này (E6F- E6R/HP18F- HP18R), được phối hợp thực hiện multiplex-PCR trong một phản ứng sử dụng một nguồn khuôn DNA tổng số tách từ mẫu bệnh phẩm. Nếu trong khuôn DNA chỉ có một loại HPV-16 hoặc HPV-18 thì chỉ có 1 băng DNA tương ứng mỗi loại được hình thành, nếu song nhiễm cả hai loại thì sẽ có khả năng có cả 2 băng DNA được thu nhận, hàm lượng DNA sản phẩm PCR phụ thuộc vào lượng khuôn DNA của mỗi loại tùy theo mức độ nhiễm virus.
Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR như sau:
Bảng 2.1. Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng multiplex-PCR HPV-16/HPV-18. Thành phần Thể tích PCR MM 25µl E6F (5pmol/µl) 1 µl E6R (5pmol/µl) 1 µl HP18R(5pmol/µl) 1 µl HP18F(5pmol/µl) 1 µl
Khuôn DNA 2 µl
DMSO 2,5 µl
H20 16,5 µl
Tổng số 50 µl
Phản ứng multiplex-PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng multiplex - PCR HPV16/HPV18
Nhiệt độ Thời gian (phút) Số chu kỳ
95oC 5 1 95oC 1 35 48oC 1 72oC 3 72oC 10 1
4oC Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm phản ứng
- Với cặp mồi EBK1F - EBVR, PCR cho phép nhân lên đoạn DNA có độ dài khoảng 800 bp. Đối tượng nhân lên trong phản ứng PCR là: Đoạn gen EBNA-1. DNA tổng số thu được ở bước trên, được dùng làm khuôn cho phản
ứng PCR. Hàm lượng DNA sử dụng cho mỗi phản ứng PCR (50 l) là khoảng
100 - 150 nanogam (ng). Phối hợp các thành phần tham gia phản ứng PCR được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR gen E6 của HPV-16 Thành phần Thể tích (µl) PCR master mix 25 Khuôn DNA (~10 - 50 ng) 2 E6 F (10 pmol/ul) 1 E6 R (10 pmol/ul) 1 DMSO 2,5
Nước tinh khiết 18,5
Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR của gen EBNA-1
Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản trước khi tinh
sạch, bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng (giải trình tự trực tiếp) hoặc nếu cần
thiết tiến hành dòng hoá vào vector để giải trình tự.
2.4.3.3 Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR nói chung được phát hiện khi điện di trên thạch (gel) agarose 0.8-2%. Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc độ khác nhau; Loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn. Agarose được chiết suất từ tảo biển, có
thể mua ở dạng bột khô. Nó bị nóng chảy ở nhiệt độ trên 45C, trong dung dịch
đệm ở nồng độ thích hợp. Khi làm nguội (dưới 45C), agarose đông lại thành