1.2.1. Dịch tễ học ung thƣ vòm mũi họng
Ung thư vòm mũi họng NPC (Nasopharyngeal carcinoma) là một khối u
ác tính xuất phát từ lớp biểu mô phủ của vùng vòm mũi họng [53]. Loại ung thư này được xếp vào các khối u biểu mô của đường tiêu hoá và hô hấp trên. Đây là một trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người Việt Nam và là loại hay gặp nhất trong các ung thư vùng tai mũi họng [23], [56].
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, vùng có nguy cơ ung thư vòm mũi họng cao nhất là miền Nam Trung Quốc và phần lớn các nước Đông Nam Á với tỷ lệ 20 – 30/100.000
dân, do đó ung thư vòm mũi họng còn gọi là U Quảng Đông [33]. Trong những vùng này, NPC là ung thư vòm mũi họng đứng hàng đầu của nam giới và chiếm tới 3/4 các loại ung thư vùng đầu cổ. Vùng có nguy cơ trung bình ở quanh bờ biển Địa Trung Hải và phía Đông Châu Phi với tỷ lệ 5 - 9/100.000 dân. Vùng có nguy cơ rất thấp 0,1- 0,5/100.000 dân như Châu Âu, Châu Mỹ và ở các nước công nghiệp phát triển (Bắc Mỹ, Nhật, Úc) là những nơi mà NPC chỉ chiếm 1- 3% vùng đầu mặt cổ.
Ngoài tính phức tạp chủng/type và đặc tính gây bệnh của EBV, còn phải kể đến sự đa nhiễm các loại virus ung thư khác như: HSV, HPV, CMV, HIV và có thể EBV tồn tại trợ giúp tương tác lẫn nhau để ung thư biểu mô phát triển mạnh hơn [48]. EBV có thể là phức hợp chính gây ra ung thư VMH và các ung thư biểu mô khác rải rác trong cơ thể, mà nguyên nhân gây bệnh cũng hết sức đa dạng, phức tạp dẫn đến việc chẩn đoán và điều trị bệnh gặp nhiều khó khăn. Có rất nhiều giả thiết, về nguyên nhân gây bệnh ung thư vòm họng nhưng tập trung
thành ba nhóm chủ yếu đó là do virus Epstein-Barr, do di truyền và do các yếu
tố môi trường, tập quán ăn uống, hoá chất [45], [69]. Trong thời gian gần đây, nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả đã chứng minh được mối liên quan
mật thiết giữa virus Epstein-Barr và ung thư vòm mũi họng. Các nghiên cứu này
đã cho thấy sự biểu lộ của các kháng nguyên virus trong các giai đoạn của bệnh
và vai trò quan trọng của virus Epstein-Barr trong bệnh học cũng như trong quá
trình sàng lọc chẩn đoán, điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24], [30], [37], [40].
1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, ung thư vòm mũi họng đứng hàng đầu trong các ung thư Tai Mũi Họng và Đầu Mặt Cổ, đứng hàng thứ 7 trong các ung thư toàn thân (7,1%). Theo UICC, ung thư vòm mũi họng chiếm 1% dân số thế giới. EBV là mối quan tâm sâu sắc của các nhà lâm sàng và sinh học phân tử, do quần thể EBV ở nước ta cũng có nhiều biến động lớn và có nét riêng biệt về đặc tính phân tử và gây bệnh [13]. Ở Việt Nam, cho đến nay đã xác định được chủng EBV giống chủng
của châu Âu B95-8 [14]. Một số chủng/type mới phát hiện được coi là nguyên nhân gây ung thư cao, thuộc nhóm lưu hành vùng Nam Trung Quốc, có những đột biến đặc biệt so với EBV của thế giới [7], [13], [67].
Một trong những phương pháp tiên tiến trong định type virus gây bệnh, là thu nhận đoạn gen (gen kháng nguyên hoặc/và độc lực) hoặc toàn bộ đoạn gen, hệ gen cần nghiên cứu bằng phản ứng PCR, sau đó so sánh trình tự của chuỗi nucleotide/amino acid của chúng, đối chiếu với các chủng/type khác trên thế giới. Hiện nay, trong Ngân hàng gen [GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)] đã có hàng trăm chuỗi nucleotid và một số hệ gen hoàn chỉnh của EBV thuộc các type khác nhau trên thế giới, đặc biệt toàn bộ hệ gen của chủng GD1 (số đăng ký: AY961628) thuộc loại độc lực cao phân lập ở Quảng Đông trong vùng dịch tễ ung thư VMH Nam Trung Quốc [67], là một nguồn dữ liệu quý giá cho việc so sánh đối chiếu các chủng/type EBV của Việt Nam. Qua nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, đã phát hiện được hàng trăm chuỗi nucleotid và một số hệ gen hoàn chỉnh của EBV trong các mô sinh thiết ung thư vòm mũi họng thuộc các type EB (WT), EB (B95-8), EB (RAJI), EB (GD1), EB (CN). Các chủng virus này có phân bố khác nhau theo các vùng trên thế giới. Chúng có độc tính và đặc tính gây bệnh khác nhau [24].
1.2.2. Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus
1.2.2.1. Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thƣ vòm mũi họng (VMH)
Năm 1958, Burkitt phát hiện ra khối u lympho xương hàm trên ở trẻ em Châu Phi, từ đó bệnh này được mang tên ông: Burkitt’s Lymphoma (BL). Năm 1964, Epstein-Bar phân lập được loại virus ở dòng Lymphoblast trong khối u BL bằng kính hiển vi điện tử [28]. Từ đó virus này được mang tên: Virus Epstein - Barr (EBV). Năm 1966, Kelein báo cáo về phản ứng miễn dịch của kháng thể dịch chống lại tế bào Lympho B nuôi cấy [34]. Cũng vào năm ấy Old báo cáo phản ứng ngưng kết của kháng thể chống kháng nguyên EBV trong ung thư VMH. Năm 1968, Henle khuấy động nền y học thế giới bởi phát hiện thấy
sự chuyển đổi từ (-) sang (+) của phản ứng miễn dịch của kháng thể chống lại EBV ở một kỹ thuật viên trong khoa của ông mà trước đó đã mắc bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng. Sau đó, Henle nghiên cứu thấy phản ứng miễn dịch huỳnh quang (+) tới 92 % ở bệnh nhân ung thư VMH. Năm 1969, phát hiện được EBV trong tế bào line của tổ chức ung thư vòm bằng kính hiển vi điện tử. Năm 1975, Nadol phân lập được các tiểu thể EBV trong tế bào biểu mô ung thư vòm bằng kính hiển vi điện tử. Đây là lần đầu thấy các tiểu thể virus Herpes
trong tế bào ung thư của người và gợi ý rằng EBV có thể là tác nhân gây ung thư [20], [60]. Đặc biệt, EBV làm chuyển dạng tế bào lympho thành nguyên bào lympho và thay đổi cả thể nhiễm sắc, đồng thời lại trung hòa kháng thể. Năm 1980, một số nghiên cứu đã tìm ra được các nhóm gen cơ bản và năm 1984 đã biết được toàn bộ chuỗi gen của EBV và ngày nay hệ gen EBV của hàng chục chủng trên thế giới đã được giải mã và nghiên cứu [31], [41], [67]).
1.2.2.2. Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV
EBV là một thành viên thuộc nhóm Herpes type 4 gây nhiễm bệnh trên người [46], được phân loại theo sơ đồ phân loại như sau: Viruses; dsDNA viruses, no RNA stage; Herpesviridae; Gamma herpesvirinae; Lympho cryptovirus; Human herpesvirus 4. (liệt kê danh pháp phân loại tại Ngân hàng
Gen:(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/ Taxonomy/taxonomyhome.html/).
EBV tồn tại dưới dạng hình khối cầu, bao gồm vỏ capsid, vỏ ngoài (envelope) và trong cùng là hệ gen virus. Cấu trúc hệ gen của EBV là chuỗi DNA xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172kb, nếu tính cả phần cấu trúc lặp ở hai đầu là 184kb. Hệ gen được chứa đựng trong vỏ capsid, có hình thái đối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín để bảo vệ nhân DNA của virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV. Capsid là vỏ được xác định bởi 20 mặt bên, với 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng theo kiểu 5-3- 2. Vỏ capsid bao gồm 162 capsome, là những đơn vị cấu trúc trên 5 đỉnh hay 6 đỉnh. Các đơn vị protein đó được mã hoá bởi các gen virus. Capsid lại được
bao quanh bởi một vỏ bao ngoài khác, gọi là vỏ ngoài (envelope), cấu trúc chủ yếu từ thành phần glycoprotein. Vỏ bao này cũng được mã hoá và cũng mang dấu ấn miễn dịch. Giữa capsid và vỏ ngoài là khoảng chứa đựng các protein đệm cấu trúc và các enzyme của virus. Vỏ ngoài của EBV có sự nhạy cảm với tác động của acid, ether, các dung dịch hoà tan, sát khuẩn và đông khô [26]. Hiện nay, có hai loại EBV được biết gây nhiễm ở người đó là: EBV-1 và EBV-2, mặc dù biểu hiện lâm sàng và gây bệnh như nhau, nhưng trong hệ gen có sự sai khác về cấu trúc gen EBNA-1.
1.2.2.3. Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thƣ của EBV
EBV là loại virus truyền nhiễm gây bệnh trên người và lan truyền qua đường tiêu hoá, thường được phát hiện trong chất thải tế bào, chất tiết ở phần trên của hệ tiêu hoá và hô hấp như nước bọt, niêm dịch vùng họng. EBV có đặc tính hướng bạch huyết hấp phụ lên tế bào Lympho B thông qua tương tác của glycoprotein gp350/220 có trên bề mặt virus với thụ thể CR2/CD21 của bổ thể C3d. Sự xâm nhập của EBV vào Lympho B còn có sự trợ giúp của phức hợp gp25 (gL), gp42/38 và gp85 (gH). Phức hợp này làm trung gian tương tác giữa EBV với MHC lớp 2 và chúng có vai trò như một tổ hợp thụ thể đồng trợ giúp cho EBV xâm nhập sâu vào tế bào Lympho B [48]. EBV gây sơ nhiễm và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh. EBV là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và có liên quan đến cơ chế tiến triển của một số loại ung thư như tăng sinh lymphoB hay Burkitt lymphoma, bệnh Hodgkin, một số dạng T-lymphoma, ung thư biểu mô như ung thư VMH và ung thư dạ dày. Đặc trưng của các khối u này là các tế bào khối u chứa một lượng lớn các bản sao hệ gen của EBV và xuất hiện sự biểu hiện các gen protein màng tàng nhiễm (LMP) cho một lượng lớn các sản phẩm protein mà nó có thể đóng vai trò chuyển hoá khối u lành thành ác tính [46].
Trong cơ thể, EBV có 3 hướng tiếp tục tiến triển được minh hoạ ở Hình 1.7: - Xâm nhập vào tế bào biểu mô và nhân lên (Hình 1.7-(2 )).
- Gây sơ nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B thực hiện sự nhân lên (Hình 1.7-(1)/(3)/(6)/(7)/(8)/(9)).
- Tàng nhiễm và tiến triển ung thư khi có đủ điều kiện (Hình 1.7-(3)/(4)). Ngoài ra, quá trình nhiễm EBV cũng có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch, chủ yếu là loại hình miễn dịch trung gian tế bào có vai trò của lympho T (Hình 1.7-(5)).
Hình 1.7. Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV trong cơ thể bị nhiễm [48].
Đối với trường hợp thứ nhất, EBV tìm thấy điều kiện thích ứng trong tế bào biểu mô và sự nhân lên của EBV thuộc loại hình gây nhiễm có sinh sản (productive infection) (Hình 1.7-(2)). EBV giải phóng ra tiếp tục các hướng tiến triển như đã nêu ở trên. EBV có thể nhân lên trong tế bào biểu mô hoặc chuyển từ sơ nhiễm sang gây nhiễm thứ cấp bằng cách nhân lên mãnh liệt trong lympho B giải phóng virus vào nước bọt hoặc có thể chuyển từ sơ nhiễm sang tàng nhiễm và tiến triển ung thư vòm họng [48].
Đối với trường hợp thứ hai, EBV sơ nhiễm sẽ tìm đến lympho B có trong vùng họng, thực hiện sự xâm nhập và nhân lên trong các tế bào này. Virus giải
phóng ra hàng loạt bằng cách dung giải tế bào, xâm nhiễm vào quần thể lympho B, gây nhiễm thứ cấp mà kết quả là có một lượng lớn EBV được tung ra, chúng có rất nhiều trong nước bọt. Lúc này, EBV lại có thể gây nhiễm các tế bào biểu mô (Hình 1.7-(7-9)).
Đối với trường hợp thứ ba, EBV thực hiện sự gây nhiễm bán sinh sản (semi-productive infection) và tàng nhiễm trong tế bào lympho B (Hình 1.7 – (4)). Nhờ trợ giúp của một số sản phẩm protein sớm (EBNA-1) và muộn (LMP- 1), EBV thực hiện quá trình chuyển đổi lympho B, non hoá và biệt hoá chúng tăng sinh và tiến triển ung thư. Tuy nhiên, quá trình ung thư do EBV khởi phát còn chịu nhiều tác động hỗ trợ của rất nhiều yếu tố mà về thực chất ngày nay còn chưa biết rõ.
1.2.2.4. Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gen của EBV
Hệ gen của EBV là cấu trúc DNA vòng, sợi đôi (dsDNA), chứa các gen mã hóa cho các protein của virus được định vị trên một sợi DNA của hệ gen. Trong Hình 1.8 là sơ đồ cấu trúc vòng DNA của hệ gen EBV, trong đó có vùng mầm và điểm khởi phát oriP; các exon mã hoá cho 6 protein kháng nguyên nhân (EBNA-1, -2, -3A, -3B -3C và EBNA-LP) và 3 protein màng (LMP-1, -2A, - 2B). Các promoter cho từng vùng sao chép được ký hiệu Cp/Wp, Qp. (b) Sơ đồ mạch thẳng của hệ gen EBV, trong đó có 6 gen EBNA và gen LMP-1 giới hạn hai đầu bởi các chuỗi kết thúc TR (terminal repeat).
Hệ gen của EBV có 6 tổ hợp gen mã hoá cho các loại protein kháng nguyên: Kháng nguyên nhân, ký hiệu là EBNA: (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA- 3B, EBNA-3C và EBNA-LP) và 3 gen mã hoá cho protein màng (LMP-1, LMP- 2A và LMP-2B) [26], [48]. Sáu protein EBNA có liên quan đến vai trò xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào Lympho B giai đoạn đầu, còn 3 loại protein LMP liên quan đến chu kỳ EBV trong dòng tế bào Lympho B đã chuyển đổi từ dạng nghỉ sang dạng thường trực - những dòng tế bào mầm gây nhiễm trùng muộn (LCL). Trong dòng tế bào LCL, EBNA được sao chép trong một RNA thông tin đơn nhất và tổng hợp thành một protein chung, sau đó được phân cắt thành các EBNA thành phần độc lập [46], [66].
1.2.2.5 Gen và sản phẩm của gen EBNA-1
Gen EBNA-1 là một đoạn DNA nằm trong tổ hợp gen EBNA mã hoá cho protein EBNA-1. EBNA-1 là chuỗi polypeptide bao gồm 641 acid amin, trong đó thành phần 3 acid amin glycine-glycine-alanine (Gly-Gly-Ala) được lặp lại nhiều
Hình 1.8. Cấu trúc hệ gen EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a) và dạng mạch thẳng (b) (Murray PG và cs, 2001 [48])
lần, mà số lượng lặp thay đổi khác nhau trong các mẫu/chủng EBV khác nhau [60]. Vùng lặp 3 acid amin Gly-Gly-Ala này có tác dụng điều hoà nghịch MHC-I và ngăn cản quá trình phân giải kháng nguyên. Nếu không có trình diện kháng nguyên phân giải thì Lympho T loại CD8 không có chức năng hoạt động để kìm hãm hoạt hoá EBNA-1. Protein EBNA-1 có vai trò thiết yếu trong quá trình xâm nhập và nhân lên cũng như duy trì sự tái tạo hệ gen của virus. Gen EBNA-1 và sản phẩm protein EBNA-1 có mặt trong tất cả mọi dạng khối u có liên quan đến EBV và gen EBNA-1 có khả năng biểu hiện protein bằng cách sử dụng một trong 4 loại promoter khởi động. EBNA-1 thực hiện chức năng bằng cách bám vào vùng
mầm oriP là điểm khởi phát sự nhân lên của DNA hệ gen EBV. EBNA-1 còn
tương tác điều hoà tiếp tục sự sao chép của tổ hợp EBNA bằng cách bám vào vị
trí Qp và promoter này được sử dụng trong tế bào nhiễm EBV theo chương trình
tàng nhiễm type 1 và tàng nhiễm type 2 [26]. Ngoài ra, có vai trò kích hoạt sao chép và điều hoà chức năng của promoter Cp và LMP-1. Vai trò trong sự hình thành khối u lymphoma tế bào B của EBNA-1 cũng được chứng minh khi gây bệnh thực nghiệm trên chuột. Trong tất cả các EBNA thì gen EBNA-1 có vai trò quan trọng trong chu kỳ tái tạo, nhân lên và gây bệnh của EBV.
1.2.3. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phƣơng pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thƣ vòm mũi họng ở Việt Nam phƣơng pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thƣ vòm mũi họng ở Việt Nam
Khi người bị nhiễm EBV có những điều kiện cần thiết cho sự tiến triển ung thư VMH và nhiễm tiềm tàng EBV vào tế bào lympho-B đủ điều kiện phát triển thành dạng ung thư Burkitt (BL), người ta luôn thấy gen EBNA-1 ở trạng thái sao chép sớm và protein luôn luôn được tổng hợp, do vậy kháng nguyên EBNA-1 xuất hiện kèm theo cho phép xác nhận tế bào đã chuẩn bị cho sự chuyển dạng sớm trở thành ung thư. Việc phát hiện gen EBNA-1 trong những tháng đầu tiên, đặc biệt là phát hiện từ tế bào lympho-B chuyển dạng có tầm quan trọng đặc biệt cho sự xác nhận chính xác bệnh nhân đã có dấu hiệu ung thư sớm [58]. VCA (Viral capsid antigen) là kháng nguyên vỏ virus, luôn luôn xuất hiện trong người nhiễm EBV, vì