Phương pháp sinh học phân tử quan trọng nhất trong chẩn đoán và định týp HPV là PCR, sử dụng các cặp mồi chung cho mọi týp HPV và đặc hiệu riêng cho từng týp riêng biệt. Do vậy, có 2 loại PCR được sử dụng: PCR chung cho mọi týp HPV và PCR riêng cho từng týp HPV.
PCR chung cho mọi týp HPV
PCR chung cho mọi týp phát hiện HPV, còn được gọi là PCR đặc hiệu theo
nhóm, gs-PCR (group-specific PCR), phát hiện virus thuộc cùng một nhóm. Một
phản ứng PCR mà phát hiện được tất cả các týp HPV và phân biệt HPV với các loại virus gây ung thư khác. Do vậy, PCR trong trường hợp này phải sử dụng
các cặp mồi (primer) chung cho nhiều týp HPV, nhưng chỉ riêng cho HPV, mà
không chung với các virus khác. Cặp mồi cổ điển nhất được thiết kế là MY09 - MY11, có khả năng nhân lên được đoạn DNA có độ dài 450 cặp nucleotid, nằm trong gen L1 là gen cấu trúc vỏ capsid của HPV [17]. Cặp mồi thứ hai là GP5 - GP6 cũng được sử dụng để thu nhận một đoạn DNA nằm bên trong giới hạn của vùng DNA do MY09 -MY11 nhân lên. Sử dụng cả hai cặp mồi MY09 - MY11 và GP5 - GP6 và phương pháp PCR lồng (Nested PCR) phản ứng được thực hiện có độ nhạy cao với lượng khuôn ban đầu chỉ cần là 0,005 - 0,010 nanogram (ng), tương đương với DNA hệ gen của 10 - 200 virus HPV.
Có khoảng 7% số lượng phản ứng PCR với cặp mồi MY09 - MY11 không cho kết quả phát hiện DNA - HPV, có thể do không có DNA của virus HPV trong tế bào ung thư của mẫu nghiên cứu hoặc DNA - HPV đã nhập gen vào tế bào CTC và do vậy virus không còn tồn tại trong bệnh phẩm [61].
Nhiều phương pháp nghiên cứu được sử dụng để định týp HPV sau khi nhân một đoạn gen bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi chung. Cặp mồi chung của PCR hoạt động trên hệ gen HPV của nhiều týp, nhưng không cho biết sản phẩm PCR là của týp nào. Do vậy, việc xác định týp chỉ có thể thành công sau khi phân tích sản phẩm. Trong nhiều cách phân tích, người ta thường sử dụng phương pháp giải trình tự (Sequencing) và so sánh đối chiếu các chuỗi nucleotid và acid amin của sản phẩm; hoặc sử dụng phương pháp phân tích đa hình RFLP (Restriction fragment length polymorphism) và hợp lai phóng xạ với các mẫu dò DNA đã biết.
Gần đây, cặp mồi ký hiệu SPF10 được thiết kế chỉ nhân được đoạn gen 65 bp (Base pair) của gen L1, nhưng rất nhạy và hầu như thực hiện được với tất cả các mẫu bệnh phẩm, kể cả bệnh phẩm cố định bằng formalin. PCR khó cho sản
phẩm dài với khuôn DNA kém chất lượng, đặc biệt là DNA tách từ mẫu cố định trong formalin. Do đó, SPF10 tỏ ra có lợi thế khi rà soát nhiều loại bệnh phẩm có chất lượng khác nhau.
PCR riêng định týp HPV
Định týp riêng biệt HPV dựa vào tìm kiếm sự khác nhau về thành phần gen trong gen E6 và E7, đây là các gen "độc", tổng hợp protein gây ung thư, do vậy chúng quyết định độc lực (tính gây bệnh) của HPV và chúng có mức độ biến đổi khác nhau. Hiện nay, đã có 14 cặp mồi đặc hiệu cho PCR, sử dụng một cách đặc hiệu và nhạy nhân đoạn gen có độ dài 100bp trong gen E7, phát hiện HPV thuộc các týp HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -66 và -68 [62]. Phản ứng có độ nhạy rất cao, chỉ cần 10 - 200 virus HPV là đủ cung cấp DNA hệ gen làm khuôn để thực hiện PCR thành công. Do có khả năng phát hiện
riêng từng týp, nên phản ứng PCR kiểu này được gọi là phản ứng PCR đặc hiệu
theo týp, ký hiệu là ts-PCR (type- specific PCR). PCR đặc hiệu theo týp hiện nay được sử dụng nhiều trong nghiên cứu, nhưng rất giới hạn trong sàng lọc bệnh phẩm đại trà, do chi phí còn rất cao.
1.1.4. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phƣơng pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam
Bệnh ung thư CTC là một bệnh phổ biến, có tỷ lệ tử vong cao trong các bệnh ung thư nói chung và ung thư đường sinh dục nữ nói riêng, có thể coi đây là một bệnh nguy hiểm đối với phụ nữ trên thế giới và đặc biệt ở Việt Nam hiện nay. Mặc dù, với sự hiểu biết ngày càng sâu sắc về nguyên nhân gây bệnh và ứng dụng các biện pháp nhằm phát hiện sớm, ngăn ngừa tiến triển của bệnh như: vệ sinh, phát hiện sớm và điều trị những tổn thương nghi ngờ, chẩn đoán sàng lọc…, nhưng cho đến nay bệnh vẫn ngày càng có xu hướng gia tăng.
Bệnh được gây ra bởi nhiều nguyên nhân đa dạng và phức tạp dẫn đến việc phát hiện, chẩn đoán và áp dụng các biện pháp điều trị, ngăn ngừa cho bệnh
nhân ở giai đoạn tiềm ẩn của bệnh gặp nhiều khó khăn. HPV đã được xác định là nguyên nhân chính gây ung thư CTC ở người và lây nhiễm chủ yếu qua đường tình dục cũng là một trong những nguyên nhân góp phần gia tăng tỷ lệ mắc mới hàng năm trong cộng đồng. Tuy nhiên, những hiểu biết về HPV và ung thư CTC đã cho thấy bệnh hoàn toàn có thể được ngăn chặn và điều trị khỏi, nếu được phát hiện và điều trị sớm. Các phương pháp chẩn đoán bệnh sử dụng phổ biến hiện nay dựa trên triệu chứng lâm sàng, chẩn đoán tế bào học, soi CTC, chẩn đoán mô bệnh học, thường chỉ phát hiện được ở giai đoạn muộn khi bệnh đã chuyển sang giai đoạn ung thư, không hoặc khó chẩn đoán được người bệnh có bị nhiễm HPV ở giai đoạn sớm, tiềm ẩn và nếu nhiễm thì thuộc týp HPV nào. Các dữ liệu về gen và hệ gen của HPV được lưu trữ trong Ngân hàng Gen [GenBank (http://www .ncbi.nlm.nih.gov)] là một nguồn dữ liệu giá trị cho việc phân tích, so sánh đối chiếu các týp HPV ở Việt Nam, qua đó lựa chọn ra các chỉ thị di truyền của HPV nhằm phục vụ cho xây dựng phương pháp phát hiện HPV lưu hành gây bệnh tại Việt Nam, giúp cho việc chẩn đoán phát hiện sớm HPV, bước đầu định hướng ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong việc chẩn đoán ung thư CTC và xác định týp HPV hay gặp ở nước ta.