EBV là một thành viên thuộc nhóm Herpes type 4 gây nhiễm bệnh trên người [46], được phân loại theo sơ đồ phân loại như sau: Viruses; dsDNA viruses, no RNA stage; Herpesviridae; Gamma herpesvirinae; Lympho cryptovirus; Human herpesvirus 4. (liệt kê danh pháp phân loại tại Ngân hàng
Gen:(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/ Taxonomy/taxonomyhome.html/).
EBV tồn tại dưới dạng hình khối cầu, bao gồm vỏ capsid, vỏ ngoài (envelope) và trong cùng là hệ gen virus. Cấu trúc hệ gen của EBV là chuỗi DNA xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172kb, nếu tính cả phần cấu trúc lặp ở hai đầu là 184kb. Hệ gen được chứa đựng trong vỏ capsid, có hình thái đối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín để bảo vệ nhân DNA của virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV. Capsid là vỏ được xác định bởi 20 mặt bên, với 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng theo kiểu 5-3- 2. Vỏ capsid bao gồm 162 capsome, là những đơn vị cấu trúc trên 5 đỉnh hay 6 đỉnh. Các đơn vị protein đó được mã hoá bởi các gen virus. Capsid lại được
bao quanh bởi một vỏ bao ngoài khác, gọi là vỏ ngoài (envelope), cấu trúc chủ yếu từ thành phần glycoprotein. Vỏ bao này cũng được mã hoá và cũng mang dấu ấn miễn dịch. Giữa capsid và vỏ ngoài là khoảng chứa đựng các protein đệm cấu trúc và các enzyme của virus. Vỏ ngoài của EBV có sự nhạy cảm với tác động của acid, ether, các dung dịch hoà tan, sát khuẩn và đông khô [26]. Hiện nay, có hai loại EBV được biết gây nhiễm ở người đó là: EBV-1 và EBV-2, mặc dù biểu hiện lâm sàng và gây bệnh như nhau, nhưng trong hệ gen có sự sai khác về cấu trúc gen EBNA-1.
1.2.2.3. Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thƣ của EBV
EBV là loại virus truyền nhiễm gây bệnh trên người và lan truyền qua đường tiêu hoá, thường được phát hiện trong chất thải tế bào, chất tiết ở phần trên của hệ tiêu hoá và hô hấp như nước bọt, niêm dịch vùng họng. EBV có đặc tính hướng bạch huyết hấp phụ lên tế bào Lympho B thông qua tương tác của glycoprotein gp350/220 có trên bề mặt virus với thụ thể CR2/CD21 của bổ thể C3d. Sự xâm nhập của EBV vào Lympho B còn có sự trợ giúp của phức hợp gp25 (gL), gp42/38 và gp85 (gH). Phức hợp này làm trung gian tương tác giữa EBV với MHC lớp 2 và chúng có vai trò như một tổ hợp thụ thể đồng trợ giúp cho EBV xâm nhập sâu vào tế bào Lympho B [48]. EBV gây sơ nhiễm và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh. EBV là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và có liên quan đến cơ chế tiến triển của một số loại ung thư như tăng sinh lymphoB hay Burkitt lymphoma, bệnh Hodgkin, một số dạng T-lymphoma, ung thư biểu mô như ung thư VMH và ung thư dạ dày. Đặc trưng của các khối u này là các tế bào khối u chứa một lượng lớn các bản sao hệ gen của EBV và xuất hiện sự biểu hiện các gen protein màng tàng nhiễm (LMP) cho một lượng lớn các sản phẩm protein mà nó có thể đóng vai trò chuyển hoá khối u lành thành ác tính [46].
Trong cơ thể, EBV có 3 hướng tiếp tục tiến triển được minh hoạ ở Hình 1.7: - Xâm nhập vào tế bào biểu mô và nhân lên (Hình 1.7-(2 )).
- Gây sơ nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B thực hiện sự nhân lên (Hình 1.7-(1)/(3)/(6)/(7)/(8)/(9)).
- Tàng nhiễm và tiến triển ung thư khi có đủ điều kiện (Hình 1.7-(3)/(4)). Ngoài ra, quá trình nhiễm EBV cũng có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch, chủ yếu là loại hình miễn dịch trung gian tế bào có vai trò của lympho T (Hình 1.7-(5)).
Hình 1.7. Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV trong cơ thể bị nhiễm [48].
Đối với trường hợp thứ nhất, EBV tìm thấy điều kiện thích ứng trong tế bào biểu mô và sự nhân lên của EBV thuộc loại hình gây nhiễm có sinh sản (productive infection) (Hình 1.7-(2)). EBV giải phóng ra tiếp tục các hướng tiến triển như đã nêu ở trên. EBV có thể nhân lên trong tế bào biểu mô hoặc chuyển từ sơ nhiễm sang gây nhiễm thứ cấp bằng cách nhân lên mãnh liệt trong lympho B giải phóng virus vào nước bọt hoặc có thể chuyển từ sơ nhiễm sang tàng nhiễm và tiến triển ung thư vòm họng [48].
Đối với trường hợp thứ hai, EBV sơ nhiễm sẽ tìm đến lympho B có trong vùng họng, thực hiện sự xâm nhập và nhân lên trong các tế bào này. Virus giải
phóng ra hàng loạt bằng cách dung giải tế bào, xâm nhiễm vào quần thể lympho B, gây nhiễm thứ cấp mà kết quả là có một lượng lớn EBV được tung ra, chúng có rất nhiều trong nước bọt. Lúc này, EBV lại có thể gây nhiễm các tế bào biểu mô (Hình 1.7-(7-9)).
Đối với trường hợp thứ ba, EBV thực hiện sự gây nhiễm bán sinh sản (semi-productive infection) và tàng nhiễm trong tế bào lympho B (Hình 1.7 – (4)). Nhờ trợ giúp của một số sản phẩm protein sớm (EBNA-1) và muộn (LMP- 1), EBV thực hiện quá trình chuyển đổi lympho B, non hoá và biệt hoá chúng tăng sinh và tiến triển ung thư. Tuy nhiên, quá trình ung thư do EBV khởi phát còn chịu nhiều tác động hỗ trợ của rất nhiều yếu tố mà về thực chất ngày nay còn chưa biết rõ.
1.2.2.4. Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gen của EBV
Hệ gen của EBV là cấu trúc DNA vòng, sợi đôi (dsDNA), chứa các gen mã hóa cho các protein của virus được định vị trên một sợi DNA của hệ gen. Trong Hình 1.8 là sơ đồ cấu trúc vòng DNA của hệ gen EBV, trong đó có vùng mầm và điểm khởi phát oriP; các exon mã hoá cho 6 protein kháng nguyên nhân (EBNA-1, -2, -3A, -3B -3C và EBNA-LP) và 3 protein màng (LMP-1, -2A, - 2B). Các promoter cho từng vùng sao chép được ký hiệu Cp/Wp, Qp. (b) Sơ đồ mạch thẳng của hệ gen EBV, trong đó có 6 gen EBNA và gen LMP-1 giới hạn hai đầu bởi các chuỗi kết thúc TR (terminal repeat).
Hệ gen của EBV có 6 tổ hợp gen mã hoá cho các loại protein kháng nguyên: Kháng nguyên nhân, ký hiệu là EBNA: (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA- 3B, EBNA-3C và EBNA-LP) và 3 gen mã hoá cho protein màng (LMP-1, LMP- 2A và LMP-2B) [26], [48]. Sáu protein EBNA có liên quan đến vai trò xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào Lympho B giai đoạn đầu, còn 3 loại protein LMP liên quan đến chu kỳ EBV trong dòng tế bào Lympho B đã chuyển đổi từ dạng nghỉ sang dạng thường trực - những dòng tế bào mầm gây nhiễm trùng muộn (LCL). Trong dòng tế bào LCL, EBNA được sao chép trong một RNA thông tin đơn nhất và tổng hợp thành một protein chung, sau đó được phân cắt thành các EBNA thành phần độc lập [46], [66].
1.2.2.5 Gen và sản phẩm của gen EBNA-1
Gen EBNA-1 là một đoạn DNA nằm trong tổ hợp gen EBNA mã hoá cho protein EBNA-1. EBNA-1 là chuỗi polypeptide bao gồm 641 acid amin, trong đó thành phần 3 acid amin glycine-glycine-alanine (Gly-Gly-Ala) được lặp lại nhiều
Hình 1.8. Cấu trúc hệ gen EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a) và dạng mạch thẳng (b) (Murray PG và cs, 2001 [48])
lần, mà số lượng lặp thay đổi khác nhau trong các mẫu/chủng EBV khác nhau [60]. Vùng lặp 3 acid amin Gly-Gly-Ala này có tác dụng điều hoà nghịch MHC-I và ngăn cản quá trình phân giải kháng nguyên. Nếu không có trình diện kháng nguyên phân giải thì Lympho T loại CD8 không có chức năng hoạt động để kìm hãm hoạt hoá EBNA-1. Protein EBNA-1 có vai trò thiết yếu trong quá trình xâm nhập và nhân lên cũng như duy trì sự tái tạo hệ gen của virus. Gen EBNA-1 và sản phẩm protein EBNA-1 có mặt trong tất cả mọi dạng khối u có liên quan đến EBV và gen EBNA-1 có khả năng biểu hiện protein bằng cách sử dụng một trong 4 loại promoter khởi động. EBNA-1 thực hiện chức năng bằng cách bám vào vùng
mầm oriP là điểm khởi phát sự nhân lên của DNA hệ gen EBV. EBNA-1 còn
tương tác điều hoà tiếp tục sự sao chép của tổ hợp EBNA bằng cách bám vào vị
trí Qp và promoter này được sử dụng trong tế bào nhiễm EBV theo chương trình
tàng nhiễm type 1 và tàng nhiễm type 2 [26]. Ngoài ra, có vai trò kích hoạt sao chép và điều hoà chức năng của promoter Cp và LMP-1. Vai trò trong sự hình thành khối u lymphoma tế bào B của EBNA-1 cũng được chứng minh khi gây bệnh thực nghiệm trên chuột. Trong tất cả các EBNA thì gen EBNA-1 có vai trò quan trọng trong chu kỳ tái tạo, nhân lên và gây bệnh của EBV.
1.2.3. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phƣơng pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thƣ vòm mũi họng ở Việt Nam phƣơng pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thƣ vòm mũi họng ở Việt Nam
Khi người bị nhiễm EBV có những điều kiện cần thiết cho sự tiến triển ung thư VMH và nhiễm tiềm tàng EBV vào tế bào lympho-B đủ điều kiện phát triển thành dạng ung thư Burkitt (BL), người ta luôn thấy gen EBNA-1 ở trạng thái sao chép sớm và protein luôn luôn được tổng hợp, do vậy kháng nguyên EBNA-1 xuất hiện kèm theo cho phép xác nhận tế bào đã chuẩn bị cho sự chuyển dạng sớm trở thành ung thư. Việc phát hiện gen EBNA-1 trong những tháng đầu tiên, đặc biệt là phát hiện từ tế bào lympho-B chuyển dạng có tầm quan trọng đặc biệt cho sự xác nhận chính xác bệnh nhân đã có dấu hiệu ung thư sớm [58]. VCA (Viral capsid antigen) là kháng nguyên vỏ virus, luôn luôn xuất hiện trong người nhiễm EBV, vì
EBV nhân lên trong tế bào biểu mô cần protein này. Đối với EBV gây nhiễm tiềm tàng lympho-B và có dấu hiệu chuyển dạng gây ung thư hay biểu mô vùng họng chuyển thành NPC, sự biểu hiện gen EBNA nói chung và EBNA-1 nói riêng cũng như thành phẩm của gen này là protein EBNA-1 trong cơ thể là chỉ thị chẩn đoán hết sức quan trọng và cần thiết xác định người bệnh xuất hiện ung thư ở giai đoạn sớm. EBNA-1 cần thiết cho virus nhân lên và khép vòng tạo episome chuẩn bị cho sự gây nhiễm tiềm tàng và chuyển dạng ung thư, do vậy, gen EBNA-1 có giá trị chẩn đoạn sớm rất cao trong ứng dụng sinh học phân tử.
Chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật PCR thông thường và PCR định lượng (real-time PCR) đã được áp dụng rộng rãi đối với phát hiện EBV ở mọi dạng gây nhiễm và gây bệnh, ở ung thư NPC hay Burkitt hoặc trong các ung thư khác có liên quan đến vai trò của EBV [29]. Một số nghiên cứu sử dụng PCR và real-time PCR đã thành công trong phát hiện EBV ở ung thư vú, trong liên kết tiến triển NPC [39], trong tế bào di căn lan toả trong cơ thể hoặc sử dụng phát hiện gen trước khi kiểm nghiệm bằng huyết thanh học và PCR còn phát hiện được EBV trong bệnh phẩm cố định paraffin hoặc mẫu máu lâm sang [38]. Như vậy, có thể phân làm 2 giai đoạn chẩn đoán: chẩn đoán sớm (trong vòng 6 tháng) sử dụng kỹ thuật phân tử phát hiện gen EBNA-1 hoặc kỹ thuật miễn dịch phát hiện sản phẩm của gen và chẩn đoán muộn kỹ thuật miễn dịch phát hiện kháng thể kháng EBNA-1.
Tuy nhiên, cho đến nay những nghiên cứu sinh học phân tử EBV và NPC ở nước ta mới chỉ dừng ở góc độ khám phá chỉ thị di truyền phân tử giúp giám sát lâm sàng chứ chưa có những nghiên cứu gen/hệ gen một cách có hệ thống để có
những giám sát dịch tễ học phân tử loại virus nguy hiểm này. Vì thế, việc chẩn
đoán sớm và phòng bệnh còn rất hạn chế. Hiện nay, phương pháp PCR sử dụng chỉ thị phân tử của EBV, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hơn nữa có thể xác định được các týp EBV đã và đang được ứng dụng vào trong chẩn đoán. Các dữ liệu về gen và hệ gen của EBV được lưu trữ trong Ngân hàng Gen [GenBank - (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)] là một nguồn dữ liệu giá trị cho việc phân tích,
so sánh đối chiếu các týp EBV ở Việt Nam, qua đó lựa chọn ra các chỉ thị di truyền của EBV nhằm phục vụ cho xây dựng phương pháp chuẩn đoán nhanh bằng kỹ thuật PCR phát hiện EBV lưu hành gây bệnh tại Việt Nam, giúp cho việc chẩn đoán phát hiện sớm EBV, bước đầu định hướng ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong việc chẩn đoán ung thư vòm họng và xác định týp EBV hay gặp ở nước ta.
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Bệnh phẩm lấy từ dịch cổ tử cung của bệnh nhân, đã được chẩn đoán ung thư cổ tử cung (Pap smear dương tính) tại Bệnh viện phụ sản Hà nội
Mẫu mô lấy từ bệnh nhân có biểu hiện ung thư vòm mũi họng qua kiểm tra tế bào tại Bệnh viện Tai mũi họng Trung ương – Hà Nội.
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị
Máy PCR (MJ Thermocycler, USA); Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI-3100 Avant Genetic Analyzer, Perkin Elmer Inc., USA); Tủ lạnh sâu -
200C và -700C (Nhật Bản); Lò vi sóng (Sam sung); Máy lắc ổn nhiệt 370
C; Máy khuấy từ; Máy làm khô và hút chân không (Speed-Vac); Máy ly tâm lạnh và ly tâm để bàn (Eppendorf); Máy khuấy trộn Vortex (Bio- Rad); Bộ điện di DNA và bộ nguồn điện di (Bio- Rad); Máy soi gel và chụp ảnh tự động (Dolphin- Doc, WEALTEC, USA); Tủ cấy vô trùng (Nhật Bản); Pipet man các loại và các dụng cụ
thuỷ tinh khác; Dụng cụ phải được vô trùng tuyệt đối (Hấp ướt 1200
C trong 20 phút).
2.2.2. Hoá chất
Hoá chất gồm: Yeast Extract (DIFCO, Mỹ), Bacto- pepton (DIFCO, Mỹ), EDTA (Sigma, Mỹ), SDS, Tris, EDTA (Sigma, Mỹ), dNTP (Promega, Mỹ), Xgal (Sigma, Mỹ), IPTG (Roth, Đức), Ampicillin, Kanamycin (Merk, Đức)....
Kít sử dụng tách DNA tổng số, kít tinh sạch DNA, bộ kít tách chiết plasmid BIONEER, (Hàn Quốc). Bộ kít dòng hóa sản phẩm PCR (Invitrogen Inc.).
Các loại enzym giới hạn (EcoRI; T4-DNA ligase...) của hãng New
England Biolabs và Invitrogen Inc. Tất cả các hoá chất này được sử dụng và bảo quản theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và được trình bày cụ thể ở mục quy trình và kỹ thuật nghiên cứu.
Các mồi để chạy PCR và sequencing được đặt tổng hợp tại Genset Pty. Ltd., Lismor, NSW, Australia
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân tích gen EBNA-1 của EBV, gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 từ mẫu bệnh phẩm thu được ở trên bằng hai lĩnh vực kĩ thuật chính:
- Kĩ thuật sinh học phân tử (molecular cloning): Phân lập gen EBNA-1 của EBV, gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 từ mẫu bệnh phẩm.
- Các chương trình tin – sinh học (bioinformatics): Thu nhận và phân tích các đặc tính sinh học (đột biến thành phần nucleotide và acid amin, các đột biến cấu trúc). Xác định tính tương đồng, gen EBNA-1 của EBV, gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 thu nhận từ mẫu bệnh phẩm trên với chuỗi gen EBNA-1, E6 và L1 các chủng EBNA-1, E6 và L1 của thế giới. Quy trình nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1.
TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU BỆNH PHẨM
(Sử dụng bộ AccuPrep™ Genomic DNA Extraction Kit(BIONEER, Hàn Quốc))
THỰC HIỆN CHUỖI PHẢN ỨNG PCR
(Virus HPV cặp mồi (E6F - E6R và HP18F – HP18R) và Virus EBV cặp mồi (EBK1F - EBVR) )
DÒNG HOÁ DNA SẢN PHẨM PCR (SỬ DỤNG VECTOR pCR2.1 TOPO) VÀ THU NHẬN DNA SẢN PHẨM DÒNG HOÁ
GIẢI TRÌNH TỰ
XỬ LÝ VÀ THU NHẬN CHUỖI GEN EBNA1 VÀ E6, L1 (Thành phần trình tự Nucleotide)
SO SÁNH PHÂN TÍCH CHUỖI GEN EBV VÀ HPV-16/ HPV-18 VỚI CÁC CHỦNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
TINH SẠCH SẢN PHẨM
2.4. Quy trình nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh chuỗi nucleotid trong một phân đoạn DNA của hệ gen là một quá trình nhiều giai đoạn: chuẩn bị các nguyên liệu DNA tổng số làm khuôn, các thành phần nguyên liệu và quy trình cho phản ứng PCR, quá trình kiểm tra tinh sạch và tạo dòng sản phẩm, quá trình tách chiết và xử lý các plasmid tái tổ hợp, quá trình giải trình tự và xử lý chuỗi nucleotid và ứng dụng
các chương trình sinh - tin học (bioinformatics) xem xét, so sánh đối chiếu và