Trong vi khuẩn tái tổ hợp sẽ có 2 hệ gen được nhân lên: hệ gen của chính vi khuẩn chủ, và hệ gen của plasmid tái tổ hợp. Tách DNA plasmid tái tổ hợp nghĩa là thu nhận hệ gen của plasmid và loại trừ hệ gen vi khuẩn chủ mà chúng ta không cần.
Sử dụng bộ hóa chấ t tách chiết plasmid tái tổ hợp của hãng Bioneer (AccuPrep™ Plasmid Mini Extraction Kit) được sử dụng hiện nay . Tách chiết
DNA plasmid được thực hiện nhờ các dung dịch có khả năng làm ly giải tế bào vi khuẩn, loại bỏ DNA hệ gen vi khuẩn khỏi DNA plasmid bằng các loại muối vô cơ có trong dung môi của bộ kít. Sau đó dung dịch chứa DNA palsmid được chuyển sang cột lọc , có cấu tạo màng lọc tích điện dương (+), chỉ giữ lại DNA plasmid tích điện âm (-), qua nhiều lần ly tâm
Các bước tiến hành tách DNA plasmid tái tổ hợp (phương pháp của Hãng sinh phẩm Bioneer)
Bước 1: Chuyển dịch nuôi cấy ở trên sang ống Eppendorf 1,5 ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế bào. Sau ly tâm bỏ dịch bên trên, giữ cặn tế bào bên dưới (dùng pipet hút hết dịch trong giữ lại cặn tế bào).
Bước 2: Thêm 250 µl dung dịch (1) vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho đều.
Bước 3: Thêm 250 µl dung dịch (2) vào hỗn dịch trên để phá màng tế bào, đậy nắp, nhẹ nhàng trộn bằng cách lắc xuôi ngược toàn bộ vài lần.
Bước 4: Thêm 350 µl dung dịch (3), trộn nhẹ nhàng, sau đó đem ly tâm ở
13000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 40
C.
Bước 5: Chuyển toàn bộ phần dịch trong bên trên lên trên màng của cột lọc. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500 µl dung dịch (D) lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 5 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới.
Bước 7: Thêm 700 µl dung dịch (4) lên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới. Ly tâm lại để làm khô cột.
Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µl dung dịch (5) lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc và thu được dịch chứa DNA plasmid ở dưới.
Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200