Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh s ạch bằng bộ k ít của Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kít) theo qui trình như sau:

Bước 1: Thêm 150 µl dung dịch PB vào ống Eppendorf chứa 30 µl sản phẩm PCR còn lại sau điện di kiểm tra sản phẩm PCR với tỷ lệ 5 : 1, trộn đều bằng pipet cho dung dịch PB tiếp xúc hoàn toàn với sản phẩm PCR trong hỗn dịch.

Bước 2: Chuyển toàn bộ dung dịch trên sang cột có màng lọc đặt trong ống hứng, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ dung dịch dưới. Khi ly tâm DNA của sản phẩm PCR mang điện tích âm được giữ lại trong màng lọc điện tích dương theo cơ chế tích điện.

Bước 3: Rửa màng lọc có DNA của PCR bằng cách cho 750 µl dung dịch

PElên trên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, rồi bỏ dịch dưới. Ly

tâm lại lần hai đảm bảo cho màng chứa DNA của PCR thật khô.

Bước 4: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, bổ sung 30 µl dung

dịch EB lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, đem ly tâm 13000

vòng/phút trong 2 phút, sau đó bỏ cột. DNA của PCR sẽ tách khỏi màng lọc cùng với dung dịch EB và chúng ta thu được mẫu DNA đã được tinh sạch.

Ký hiệu mẫu và bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng.

2.4.4. Phƣơng pháp tạo dòng sản phẩm PCR

2.4.4.1 Tạo vectơ tái tổ hợp

Sản phẩm phản ứng PCR sẽ được gắn vào vector pCR 2.1 - TOPO (Hình

2.2) theo phương pháp dòng hóa TA (TA - cloning) của hãng Invitrogen , có enzym topoisomerase làm enzym nối . Nguyên lý của quá trình tái tổ hợp này là :

Do sản phẩm PCR thông thường được gắn thêm Adenine (A) vào đầu cuối 3’, vì

có sử dụng enzym Taq , nên khi nối với vector pCR 2.1 có đầu lồi Thymine (T) đã được hãng Invitrogen thiết kế từ trước , thì hai nucleotide này sẽ gắn nối bổ sung cho nhau.

Hình 2.2. Cấu trúc vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen)

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng

Tên hóa chất Thể tích (µl)

Nước tinh khiết 3

DNA khuôn 1

Vector TOPO pCR2.1 1

Salt solution 1

Tổng thể tích 6

2.4.4.2. Biến nạp

Vectơ tái tổ hợp được đưa vào tế bào E. coli chủng DH 5α bằng một quá

trình gọi là biến nạp. Đó là quá trình tạo cho plasmid đã được gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên qua màng vào trong nguyên sinh chất. Khi đã được biến nạp, plasmid (có thể tái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môi trường dinh dưỡng thích hợp.

Quy trình biến nạp nhƣ sau:

DH 5α, rồi ủ trong đá lạnh (0- 4C) trong 35- 45 phút, cho plasmid xuyên qua

màng biến nạp vào tế bào. Sau đó hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 42C trong 45

giây và ngay lập tức chuyển vào ủ trên đá lạnh trong 2 phút. Cho vào hỗn dịch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

tế bào nói trên 250 l môi trường dinh dưỡng có tên gọi là SOC [thành phần:

Trypton (20 g/l); dịch chiết nấm men (5 g/l); NaCl (10 mM); KCl (2.5 mM);

MgCl2 (10 mM); MgSO4 (10 mM) và glucose (20 mM)]. Toàn bộ hỗn hợp này

được lắc 220 vòng /phút ở nhiệt độ 37C trong 1 giờ để vi khuẩn tái tổ hợp nhân

lên trong vài chu kỳ sinh trưởng và phát triển. Lấy khoảng 100- 150 l của toàn

bộ hỗn hợp sau khi nuôi 1 giờ này dàn đều trên mặt thạch (LB agar 1,5%) có

chứa kháng sinh Kanamycin và X -gal và ủ ở 37C trong 18- 20 giờ.

2.4.4.3. Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp

Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng hai phương pháp: chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X -gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn không biến nạp thành công vectơ tái tổ hợp, và chọn lọc theo phương pháp kháng sinh (Kanamycin hoặc Ampicillin) nhằm loại trừ những vi khuẩn không biến nạp được bất kỳ vectơ nào và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác.

+ Theo cơ chế X -gal

Chọn những khuẩn lạc có màu trắng mang vectơ tái tổ hợp, không chọn

những khuẩn lạc có màu xanh. Vi khuẩn E. coli không chứa plasmid tái tổ hợp

thì sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản xuất enzym -galactosidase và sẽ phân huỷ cơ

chất X -gal có trong môi trường tạo nên dẫn xuất indol, dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hoá cho màu xanh. Nếu có đoạn DNA ngoại lai (ở đây là DNA

vùng siêu biến đổi) xen vào giữa gen lacZ thì gen này sẽ bị bất hoạt, enzym -

galactosidase không được sản xuất, vì thế mặc dù có X -gal trong môi trường, nhưng cơ chất này không bị phân huỷ, không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng. Chọn những khuẩn lạc có màu trắng ngà là tốt nhất.

+ Theo cơ chế kháng sinh

Tế bào E. coli nguyên thuỷ, không tiếp nhận được plasmid tái tổ hợp khi nuôi cấy trên thạch cho dù có X -gal hay không, nếu không có kháng sinh ức chế, chúng vẫn phát triển thành khuẩn lạc có màu trắng và dễ nhầm lẫn với khuẩn lạc của vi khuẩn tái tổ hợp. Do vậy người ta phải dùng kháng sinh (Kanamycin và /hoặc Ampicillin) để loại trừ chúng. Chúng sẽ bị kháng sinh tiêu diệt, còn vi khuẩn tiếp nhận plasmid pCR2.1 (tái tổ hợp hoặc không tái tổ hợp) có chứa gen sản xuất enzym phá huỷ kháng sinh nên tồn tại và phát triển thành khuẩn lạc.

Cách tiến hành (thực hiện trong buồng cấy vô trùng Laminair)

- Khuẩn lạc màu trắng trên môi trường LB agar được lựa chọn nuôi cấy trong các ống chứa 5 ml môi trường LB [Bactotryptone hoặc casein hydrolysate (10g/l), dịch chiết nấm men (5 g/l) và NaCl (10g/l)], khoảng 10ml nước thịt /ống.

- Bổ sung 5 µl Kanamycin nồng độ là khoảng 50 g/ml để chọn lọc dòng

có mang gen kháng kháng sinh.

- Có thể bổ sung thêm X-gal vào môi trường để loại bỏ những ống môi trường có màu xanh (do đoạn gen chưa gài vào vector) mà khi chọn lọc khuẩn lạc bị lẫn tạp hoặc khi chọn lọc khuẩn lạc có nhân hơi xanh.

- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trường được lắc 200 vòng/phút trong 16

– 20 giờ ở 370C cho vi khuẩn nhân lên.

2.4.4.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp

Trong vi khuẩn tái tổ hợp sẽ có 2 hệ gen được nhân lên: hệ gen của chính vi khuẩn chủ, và hệ gen của plasmid tái tổ hợp. Tách DNA plasmid tái tổ hợp nghĩa là thu nhận hệ gen của plasmid và loại trừ hệ gen vi khuẩn chủ mà chúng ta không cần.

Sử dụng bộ hóa chấ t tách chiết plasmid tái tổ hợp của hãng Bioneer (AccuPrep™ Plasmid Mini Extraction Kit) được sử dụng hiện nay . Tách chiết

DNA plasmid được thực hiện nhờ các dung dịch có khả năng làm ly giải tế bào vi khuẩn, loại bỏ DNA hệ gen vi khuẩn khỏi DNA plasmid bằng các loại muối vô cơ có trong dung môi của bộ kít. Sau đó dung dịch chứa DNA palsmid được chuyển sang cột lọc , có cấu tạo màng lọc tích điện dương (+), chỉ giữ lại DNA plasmid tích điện âm (-), qua nhiều lần ly tâm

Các bước tiến hành tách DNA plasmid tái tổ hợp (phương pháp của Hãng sinh phẩm Bioneer) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Bước 1: Chuyển dịch nuôi cấy ở trên sang ống Eppendorf 1,5 ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế bào. Sau ly tâm bỏ dịch bên trên, giữ cặn tế bào bên dưới (dùng pipet hút hết dịch trong giữ lại cặn tế bào).

Bước 2: Thêm 250 µl dung dịch (1) vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho đều.

Bước 3: Thêm 250 µl dung dịch (2) vào hỗn dịch trên để phá màng tế bào, đậy nắp, nhẹ nhàng trộn bằng cách lắc xuôi ngược toàn bộ vài lần.

Bước 4: Thêm 350 µl dung dịch (3), trộn nhẹ nhàng, sau đó đem ly tâm ở

13000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 40

Bước 5: Chuyển toàn bộ phần dịch trong bên trên lên trên màng của cột lọc. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới.

Bước 6: Thêm 500 µl dung dịch (D) lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 5 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới.

Bước 7: Thêm 700 µl dung dịch (4) lên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới. Ly tâm lại để làm khô cột.

Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µl dung dịch (5) lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc và thu được dịch chứa DNA plasmid ở dưới.

Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200

2.4.4.5. Kiểm tra DNA tái tổ hợp

DNA ngoại lai là sản phẩm của PCR được tạo dòng vào plasmid pCR2.1 sẽ được plasmid nhân lên trong tế bào E. coli và được tách chiết như đã giới thiệu. Vấn đề là cần thiết kiểm tra, liệu đoạn DNA ngoại lai có phải là từ sản phẩm PCR chúng ta mong muốn hay không? Một trong những phương pháp nhanh nhất là kiểm tra độ dài của đoạn DNA ngoại lai xem có đúng như độ dài của sản phẩm trước khi tạo dòng hay không.

Plasmid pCR2.1 có độ dài là 3.9 kp. Tại hai đầu của vùng tiếp nhận DNA

ngoại lai, người ta đã bố trí hai điểm cắt của enzym giới hạn EcoRI

Vị trí cắt của enzym EcoRI: 5'... G|AATTC...3' 3'...CTTAA|G...5'

Vậy khi cắt DNA của plasmid tái tổ hợp sẽ có hai băng DNA: một băng có độ dài 3.9 kp của chính DNA plasmid, băng kia sẽ cho độ dài tương ứng với sản phẩm PCR (với điều kiện trong chuỗi DNA của PCR không có điểm cắt

khác của EcoRI). Nếu trong đó có một hay vài điểm cắt EcoRI, thì độ dài của

PCR khi kiểm tra sẽ bằng tổng số băng cộng lại. Từ đó ta biết được: 1) PCR có

được tạo dòng hay không; 2) Độ dài của sản phẩm được tạo dòng là bao nhiêu

và ước định có phải của PCR mong muốn hay không; 3) Từ đó, có nên tiến hành

giải trình tự để biết chính xác chuỗi nucleotid hay không. Tiến hành cắt kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp

Bảng 2.6. Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI

Tên hóa chất Thể tích (µl)

Nước tinh khiết 16

Dung dịch đệm của enzym EcoRI 2

Enzym EcoRI 1

DNA plasmid tái tổ hợp 1

Hỗn hợp phản ứng trên được trộn đều trong một ống Eppendorf và ủ ở

370C trong 2 giờ cho phản ứng xảy ra . Điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

nếu có đoạn DNA cần thiết chèn vào vector , chúng ta sẽ tiến hành giải trình tự gen cần xác định.

2.4.5. Giải trình tự và xử lý số liệu

Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotid của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu. Đây là một phương pháp đơn giản kết hợp ba bước của một phản ứng, bao gồm: bung liên kết, bám mồi và tổng hợp sợi đơn nucleotid. Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận được bao giờ cũng được xác định theo chiều 5'- 3'. Mỗi một lần giải trình trình tự, chuỗi thô (chuỗi có thành phần DNA ban đầu chưa được xử lý) có độ dài khoảng vài trăm cho đến 1000 nucleotid thông thường là 500- 700 nucleotid.

Thành phần cơ bản nhất trong giải trình tự là DNA cần giải trình. Giải trình tự có các thành phần tham gia giống như thành phần tham gia phản ứng PCR, nhưng có một số đặc trưng riêng biệt như sau:

- Mồi tham gia phản ứng giải trình trình tự là 1 chuỗi oligonucleotid. Chuỗi này bám vào vùng DNA nằm trên sợi đối xứng bổ sung. Sau n chu kỳ sẽ

có 2n sợi đơn DNA được tạo ra, bắt đầu từ vị trí bám của mồi và kéo dài theo

chiều 5'- 3'. Sản phẩm cuối cùng có độ dài ngắn khác nhau, phụ thuộc vào thành phần, nồng độ của mồi, độ tinh khiết của DNA, hoạt tính của enzym DNA- polymerase và nhiều thành phần khác.

- Các thành phần base chứa nitơ tham gia giải trình trình tự được cung cấp ở dạng dideoxy (ddNTP) chứ không phải ở dạng deoxy như trong phản ứng PCR. Hỗn hợp bao gồm 4 thành phần: ddATP (dideoxy Triphosphate), ddCTP (dideoxy Cytosine Triphosphate), ddGTP (dideoxy Guanosine Triphosphate) và ddTTP (dideoxy Thymine Triphosphate).

giải trình tự tự động ABI-3100 Avant của Hãng Perkin-Elmer (Mỹ) trực tiếp từ sản phẩm đã được tinh sạch hay từ DNA plasmid tái tổ hợp, sau khi dòng hoá vào vectơ pCR2.1 của bộ hoá chất TA-cloning Kit (Invitrogen Inc.).

- Đối với giải trình tự trực tiếp: Dùng mồi đơn là 1 trong 2 primer đã sử

dụng cho PCR ở trên với thuốc nhuộm huỳnh quang thích hợp.

- Đối với trường hợp sản phẩm PCR được dòng hoá: Do hai đầu biên bao

quanh DNA tái tổ hợp, chuỗi DNA của vectơ được bố trí vị trí cho mồi xuôi M13F (forward) và mồi ngược M13R (reverse) bám vào, nên trong quá trình giải trình tự, chúng sẽ cho trật tự nucleotid từ điểm bám xuyên ngang qua DNA ngoại lai, cho chúng ta chuỗi thô nucleotid của DNA plasmid tái tổ hợp. Các chuỗi thô được xử lý bằng chương trình máy tính (SeqEd 1.03), để có chuỗi có trình tự tốt hơn trước khi đối chiếu.

- Sau khi đối chiếu, chúng ta thu được chuỗi cuối cùng và có thể xem xét cấu trúc gen hoặc /và acid amin bằng các chương trình sinh – tin học chuyên biệt.

Các bước tiến hành:

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng tạo DNA sợi đơn

Thành phần Thể tích (µl) Mồi (1 pmol/µl) 1,6 Nước 5,9 Khuôn DNA (~150 ng/µl) 1,5 Big Dye 1 Enhancer (1X) 10 Tổng 20

Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng giải trình tự

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

960C 5 phút 1

960C 30 giây

680C 4 phút

40C Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm phản ứng

* Tinh sạch sản phẩm phản ƣ́ng giải trình tƣ̣

Sau khi thực hiện xong phản ứng giải trình trình tự bằng máy PCR, tiến hành tinh sạch sản phẩm phản ứng trên. Các bước tiến hành tich sạch: (xem phụ lục )

* Xử lý chuỗi gen và số liệu

Trình tự chuỗi nucleotide được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng trên máy tính Macintosh bao gồm: chương trình SeqEd1.03 thu nhận chuỗi thô; sau đó so sánh các chuỗi đã thu nhận sử dụng chương trình AsemblyLIGNv1.9c và hệ chương trình MacVector8.2 (Accelrys Inc.).

So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của các chuỗi cuối cùng thu nhận được với các chuỗi có trong Ngân hàng gen quốc tế (GenBank) bằng chương trình GENEDOC2.5. Thành phần amino acid được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi khuẩn, bacterial code).

Sau khi thu nhận trình tự các chủng EBNA-1 và E6/L1, một số chủng virus EBV và HPV của thế giới được chọn lọc để so sánh sử dụng chương trình MEGA4.1 (Molecular Evolutionary Gentics Analysis v4.1) theo thông số Neighbor-Joining (NJ). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi được xếp theo 2 nhóm kết quả chính như sau:

3.1. KẾT QUẢ THU NHẬN, GIẢI TRÌNH TRÌNH TỰ VÀ XÁC ĐỊNH GEN E6 CỦA HPV-16 VÀ L1 CỦA HPV-18 GEN E6 CỦA HPV-16 VÀ L1 CỦA HPV-18

3.1.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm bệnh nhân HPV được tách chiết DNA tổng số bằng bộ k ít “AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit” (Bioneer), tiến hành tách chiết theo đúng quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất . DNA tổng số sau khi tách chiết được điện di ki ểm tra trên thạch agarose 1%, và chụp ảnh trên máy Wealtec Dolphin – DOC (Hình 3.1)

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm

(Ghi chú: M: Chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể được cắt bằng HindIII;

PK10, PK11, PK12 và PS16: DNA tổng số của mẫu HPV)

Kết quả hình 3.1 cho thấy, bốn giếng PK10, PK11, PK12 và PS16 là DNA tổng số của mẫu bệnh phẩm HPV là một băng sáng rõ nét . Chứng tỏ DNA tổng số đã tách chiết có chất lượng tốt, độ tinh sạch cao, không bị đứt gãy do đó được

sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR nhằm thu nhận số lượng lớn

phân đoạn gen L1 và E6.

PK10 PK11 PK12 PS16 M PK10 PK11 PK12 PS16 M

3.1.2. Kết quả thực hiên phản ứng Multiplex-PCR phát hiện HPV-16 và HPV-18

Sau khi thử nghiệm chính thức tối ưu hóa cặp mồi cho từng khuôn riêng biệt, chúng tôi tiến hành sử dụng 2 cặp mồi E6F - E6R và HP18F - HP18R và thực hiện multiplex-PCR, theo phương pháp trình bày tại Chương 2: Đối tượng

Mục lục