Sản phẩm PCR nói chung được phát hiện khi điện di trên thạch (gel) agarose 0.8-2%. Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc độ khác nhau; Loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn. Agarose được chiết suất từ tảo biển, có
thể mua ở dạng bột khô. Nó bị nóng chảy ở nhiệt độ trên 45C, trong dung dịch
đệm ở nồng độ thích hợp. Khi làm nguội (dưới 45C), agarose đông lại thành
gel. Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó. Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại. Kích thước các băng DNA
Nhiệt độ Thời gian (phút) Số chu kỳ
94oC 5 1 94oC 1 35 580C 1 72oC 1 72oC 10 1
được so sánh với chỉ thị di truyền (DNA marker) được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt.
Cách tiến hành như sau:
- Chuẩn bị gel agarose 0.8% (thường được dùng nhiều nhất): Lấy 0.32g thạch agarose nguyên chất, cho vào cốc đong thuỷ tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40ml đệm TAE 1 lần (1xTAE). Cho vào lò vi sóng, đặt nóng chảy trong 3 phút
sao cho agarose tan chảy hết. Đổ thạch đã tan chảy (nhiệt độ 550
C- 600C) vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng vào (tuỳ theo cần bao nhiêu mẫu mà bố trí lược có 4, 8 hay 15 răng) và đổ ngập răng lược khoảng 0.5 cm và để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi nguội (sau 60-120 phút), các răng lược sẽ tạo thành các giếng để chúng ta cho sản phẩm PCR vào kiểm tra.
- Dìm ngập khay có gel trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần (đệm TAE cung cấp ion cho điện trường hoạt động).
- Tra mẫu: Lấy 10 l sản phẩm PCR mỗi loại, trộn với 2 l chất chỉ thị tra mẫu (loading dye 3X) (thành phần chủ yếu là xanh Bromophenol) với mẫu và tra riêng biệt vào từng lỗ giếng trong bản gel.
- Tra chỉ thị phân tử (Marker): Trong 1 giếng riêng biệt khác cho 10l (0.5g) chỉ thị phân tử (thường dùng: DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt
bằng enzym giới hạn HindIII).
- Chạy điện di ở 100V trong 20 phút.
- Phát hiện DNA của sản phẩm: Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (2g/ml; 15 l/bản gel), lắc đều trên máy lắc trong 10 phút.
- Rửa gel bằng nước cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh bằng máy Dolphin-Doc (WEALTEC, USA).