Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu

2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị

Máy PCR (MJ Thermocycler, USA); Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI-3100 Avant Genetic Analyzer, Perkin Elmer Inc., USA); Tủ lạnh sâu -

200C và -700C (Nhật Bản); Lò vi sóng (Sam sung); Máy lắc ổn nhiệt 370

C; Máy khuấy từ; Máy làm khô và hút chân không (Speed-Vac); Máy ly tâm lạnh và ly tâm để bàn (Eppendorf); Máy khuấy trộn Vortex (Bio- Rad); Bộ điện di DNA và bộ nguồn điện di (Bio- Rad); Máy soi gel và chụp ảnh tự động (Dolphin- Doc, WEALTEC, USA); Tủ cấy vô trùng (Nhật Bản); Pipet man các loại và các dụng cụ

thuỷ tinh khác; Dụng cụ phải được vô trùng tuyệt đối (Hấp ướt 1200

C trong 20 phút).

2.2.2. Hoá chất

Hoá chất gồm: Yeast Extract (DIFCO, Mỹ), Bacto- pepton (DIFCO, Mỹ), EDTA (Sigma, Mỹ), SDS, Tris, EDTA (Sigma, Mỹ), dNTP (Promega, Mỹ), Xgal (Sigma, Mỹ), IPTG (Roth, Đức), Ampicillin, Kanamycin (Merk, Đức)....

Kít sử dụng tách DNA tổng số, kít tinh sạch DNA, bộ kít tách chiết plasmid BIONEER, (Hàn Quốc). Bộ kít dòng hóa sản phẩm PCR (Invitrogen Inc.).

Các loại enzym giới hạn (EcoRI; T4-DNA ligase...) của hãng New

England Biolabs và Invitrogen Inc. Tất cả các hoá chất này được sử dụng và bảo quản theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và được trình bày cụ thể ở mục quy trình và kỹ thuật nghiên cứu.

Các mồi để chạy PCR và sequencing được đặt tổng hợp tại Genset Pty. Ltd., Lismor, NSW, Australia

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân tích gen EBNA-1 của EBV, gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 từ mẫu bệnh phẩm thu được ở trên bằng hai lĩnh vực kĩ thuật chính:

- Kĩ thuật sinh học phân tử (molecular cloning): Phân lập gen EBNA-1 của EBV, gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 từ mẫu bệnh phẩm.

- Các chương trình tin – sinh học (bioinformatics): Thu nhận và phân tích các đặc tính sinh học (đột biến thành phần nucleotide và acid amin, các đột biến cấu trúc). Xác định tính tương đồng, gen EBNA-1 của EBV, gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 thu nhận từ mẫu bệnh phẩm trên với chuỗi gen EBNA-1, E6 và L1 các chủng EBNA-1, E6 và L1 của thế giới. Quy trình nghiên cứu được trình bày ở hình 2.1.

TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU BỆNH PHẨM

(Sử dụng bộ AccuPrep™ Genomic DNA Extraction Kit(BIONEER, Hàn Quốc))

THỰC HIỆN CHUỖI PHẢN ỨNG PCR

(Virus HPV cặp mồi (E6F - E6R và HP18F – HP18R) và Virus EBV cặp mồi (EBK1F - EBVR) )

DÒNG HOÁ DNA SẢN PHẨM PCR (SỬ DỤNG VECTOR pCR2.1 TOPO) VÀ THU NHẬN DNA SẢN PHẨM DÒNG HOÁ

GIẢI TRÌNH TỰ

XỬ LÝ VÀ THU NHẬN CHUỖI GEN EBNA1 VÀ E6, L1 (Thành phần trình tự Nucleotide)

SO SÁNH PHÂN TÍCH CHUỖI GEN EBV VÀ HPV-16/ HPV-18 VỚI CÁC CHỦNG VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI

TINH SẠCH SẢN PHẨM

2.4. Quy trình nghiên cứu

Nghiên cứu so sánh chuỗi nucleotid trong một phân đoạn DNA của hệ gen là một quá trình nhiều giai đoạn: chuẩn bị các nguyên liệu DNA tổng số làm khuôn, các thành phần nguyên liệu và quy trình cho phản ứng PCR, quá trình kiểm tra tinh sạch và tạo dòng sản phẩm, quá trình tách chiết và xử lý các plasmid tái tổ hợp, quá trình giải trình tự và xử lý chuỗi nucleotid và ứng dụng

các chương trình sinh - tin học (bioinformatics) xem xét, so sánh đối chiếu và

tìm kiếm hiệu quả của chuỗi nucleotid vừa thu nhận được.

2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản

- Cách lấy mẫu:

1. Sử dụng tăm bông hoặc que quệt bẹt (Ayre), cách lấy mẫu giống như

làm phiến đồ Pap smear, phết dịch niêm mạc CTC trên lam kính. Tổng số gồm

04 mẫu ký hiệu PK10, PK11, PK12 và PS16 thu tại Hà Nội. Mẫu thu được để khô tự nhiên. Sau đó, cho vào một hộp giấy sạch và được đưa về phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học, bảo đảm an toàn sinh học cao. Bảo quản ở

-200C (tủ lạnh âm sâu) cho đến khi tiến hành tách mẫu.

2. Các bệnh viện tại Hà Nội chuyên khoa tai - mũi - họng xét nghiệm bệnh nhân, thu mẫu mô có biểu hiện NPC qua kiểm tra tế bào. Mẫu mô ở dạng

tươi, bảo quản ở -200

C.Những mẫu được chẩn đoán có tế bào ung thư sẽ được

giữ lại và bảo quản trong cồn 70%/epp 1,5ml. Ngay sau đó, cho mẫu vào đá lạnh và đưa về phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học. Bảo quản ở -

200C (tủ lạnh âm) cho đến khi tiến hành tách DNA tổng số virus.

2.4.2. Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số

Virus lây nhiễm tồn tại trong tế bào của bệnh phẩm, nên muốn tách được hệ gen của virus, chúng ta có thể tiến hành tách toàn bộ DNA có trong tế bào, trong đó có DNA của hệ gen virus (nếu tế bào nhiễm EBV và HPV); DNA của nhân tế bào chủ (tế bào người) và của hệ gen ty thể; RNA các loại (nếu không

dùng enzym phá hủy RNA) và có thể có RNA khác. Toàn bộ DNA tách được được gọi là DNA tổng số hay DNA toàn bộ (DNA hỗn hợp) (total genomic DNA). Quy trình tách chiết DNA tổng số sử dụng AccuPrep™ Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Hàn Quốc) được mô tả tóm tắt như sau: mẫu bảo quản -

200C được lấy ra và để ở nhiệt độ phòng cho tan. Mẫu vật được nghiền kỹ và xử

lý với các dung môi của kít, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết DNA theo qui trình tách chiết của hãng. Cụ thể các bước như sau:

1. Cho bệnh phẩm vào ống Eppendorf sạch. Cho tiếp 20 l Proteinase K và

thêm 180l Buffer ATL, trộn đều. ủ ở 560C trong 3 giờ.

2. Thêm 4 l RNAase và 200 l Buffer AL. Ủ ở 700C trong 30 phút. Thêm

200l Ethanol (96- 100%), trộn đều.

3. Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.

Loại bỏ dịch dưới.

4. Thêm 500 l Buffer AW1, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch

dưới.

5. Thêm 500 l Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch

dưới. Tiếp tục ly tâm thêm một lần nữa như trên.

6. Chuyển cột lọc đã giữ lại DNA hệ gen của virus trong màng lọc sang

ống Eppendorf loại 1,5 ml. Thêm 100 l Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng

trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, đó là DNA tổng số trong đó có hệ gen DNA của virus HPV.

Ký hiệu mẫu, bảo quản ở -200

C.

DNA tổng số tách chiết ra được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 0,8%. Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút. Chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel Dolphin-Doc (WEALTEC, USA).

2.4.3 Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR 2.4.3.1 Thiết kế mồi 2.4.3.1 Thiết kế mồi

Dùng phương pháp truy cập Ngân hàng gen [GenBank (http://www. ncbi.nlm.nih.gov)], để tìm kiếm tất cả các chuỗi nucleotid hiện có của tất cả các

chủng/týp thuộc họ Papillomavirus và Epstein-Barr Virus đã được đăng ký cho

đến hiện nay.

Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR:

- Thiết kế cặp mồi cho gen E6 của HPV-16 chúng tôi chọn cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn DNA vùng "siêu biến đổi" thuộc gen E6 bằng phản ứng PCR, dựa trên cơ sở các trình tự bảo tồn của gen E6, gồm mồi xuôi E6F và mồi ngược E6R.

E6F: 5-CAAGCAACAGTTACTGCGA-3

E6R: 5-CAACAAGACATACATCGACC-3.

Sản phẩm PCR thu được có độ dài là 321 bp.

- Thiết kế cặp mồi cho HPV-18 chúng tôi đã chọn cặp mồi (primer) đặc

hiệu để nhân bản DNA đích của HPV-18 bằng phản ứng PCR dựa trên cơ sở các trình tự bảo tồn của gen L1, gồm mồi xuôi HP18F và mồi ngược HP18R. Trình tự cặp mồi cho HPV-18 là:

HP18F: 5'- AGGCACAGGGTCATAACAATGG -3'; HP18R: 5'- CGCTTGGCAGGTTTAGAAGACG -3'. Sản phẩm PCR thu được có độ dài là 556 bp.

- Thiết kế cặp mồi cho EBNA-1 chúng tôi đã chọn cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn DNA gen EBNA-1 có vai trò chủ đạo trong chu kỳ tái tạo, nhân lên và gây bệnh của EBV. Các trình tự tương ứng với đoạn DNA nghiên cứu từ

một số chủng/týp thuộc Epstein-Barr Virus đã được đăng ký tại Ngân hàng Gen

vùng nói trên được nhân lên bằng phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi (primer pairs) bám vào gen EBNA-1, như sau:

EBK1F: 5’-GTCATCATCATCCGGGTCTC-3’ EBV1R: 5’ -CGATTGAGGGCGTCTCCTAAC- 3’

Sản phẩm PCR thu nhận đoạn gen EBNA-1 có độ dài khoảng 800 bp.

2.4.3.2 Quy trình phản ứng PCR

DNA tổng số thu được được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, với

hàm lượng DNA sử dụng cho mỗi phản ứng PCR (dung tích 50 l) là khoảng

100-150 nanogam (ng).

Với cặp mồi E6F - E6R, đoạn DNA nhân lên bằng PCR có độ dài 321 bp, với đối tượng nhân lên trong phản ứng PCR là đoạn gen E6 của HPV-16. Với cặp mồi HP18F- HP18R, đoạn DNA nhân lên bằng PCR có độ dài 556 bp, với đối tượng nhân lên trong phản ứng PCR là đoạn gen L1 của HPV-18. Hai cặp mồi này (E6F- E6R/HP18F- HP18R), được phối hợp thực hiện multiplex-PCR trong một phản ứng sử dụng một nguồn khuôn DNA tổng số tách từ mẫu bệnh phẩm. Nếu trong khuôn DNA chỉ có một loại HPV-16 hoặc HPV-18 thì chỉ có 1 băng DNA tương ứng mỗi loại được hình thành, nếu song nhiễm cả hai loại thì sẽ có khả năng có cả 2 băng DNA được thu nhận, hàm lượng DNA sản phẩm PCR phụ thuộc vào lượng khuôn DNA của mỗi loại tùy theo mức độ nhiễm virus.

Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR như sau:

Bảng 2.1. Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng multiplex-PCR HPV-16/HPV-18. Thành phần Thể tích PCR MM 25µl E6F (5pmol/µl) 1 µl E6R (5pmol/µl) 1 µl HP18R(5pmol/µl) 1 µl HP18F(5pmol/µl) 1 µl

Khuôn DNA 2 µl

DMSO 2,5 µl

H20 16,5 µl

Tổng số 50 µl

Phản ứng multiplex-PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng multiplex - PCR HPV16/HPV18

Nhiệt độ Thời gian (phút) Số chu kỳ

95oC 5 1 95oC 1 35 48oC 1 72oC 3 72oC 10 1

4oC Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm phản ứng

- Với cặp mồi EBK1F - EBVR, PCR cho phép nhân lên đoạn DNA có độ dài khoảng 800 bp. Đối tượng nhân lên trong phản ứng PCR là: Đoạn gen EBNA-1. DNA tổng số thu được ở bước trên, được dùng làm khuôn cho phản

ứng PCR. Hàm lượng DNA sử dụng cho mỗi phản ứng PCR (50 l) là khoảng

100 - 150 nanogam (ng). Phối hợp các thành phần tham gia phản ứng PCR được trình bày ở Bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR gen E6 của HPV-16 Thành phần Thể tích (µl) PCR master mix 25 Khuôn DNA (~10 - 50 ng) 2 E6 F (10 pmol/ul) 1 E6 R (10 pmol/ul) 1 DMSO 2,5

Nước tinh khiết 18,5

Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR của gen EBNA-1

Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản trước khi tinh

sạch, bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng (giải trình tự trực tiếp) hoặc nếu cần

thiết tiến hành dòng hoá vào vector để giải trình tự.

2.4.3.3 Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR nói chung được phát hiện khi điện di trên thạch (gel) agarose 0.8-2%. Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc độ khác nhau; Loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn. Agarose được chiết suất từ tảo biển, có

thể mua ở dạng bột khô. Nó bị nóng chảy ở nhiệt độ trên 45C, trong dung dịch

đệm ở nồng độ thích hợp. Khi làm nguội (dưới 45C), agarose đông lại thành

gel. Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó. Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại. Kích thước các băng DNA

Nhiệt độ Thời gian (phút) Số chu kỳ

94oC 5 1 94oC 1 35 580C 1 72oC 1 72oC 10 1

được so sánh với chỉ thị di truyền (DNA marker) được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt.

Cách tiến hành như sau:

- Chuẩn bị gel agarose 0.8% (thường được dùng nhiều nhất): Lấy 0.32g thạch agarose nguyên chất, cho vào cốc đong thuỷ tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40ml đệm TAE 1 lần (1xTAE). Cho vào lò vi sóng, đặt nóng chảy trong 3 phút

sao cho agarose tan chảy hết. Đổ thạch đã tan chảy (nhiệt độ 550

C- 600C) vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng vào (tuỳ theo cần bao nhiêu mẫu mà bố trí lược có 4, 8 hay 15 răng) và đổ ngập răng lược khoảng 0.5 cm và để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi nguội (sau 60-120 phút), các răng lược sẽ tạo thành các giếng để chúng ta cho sản phẩm PCR vào kiểm tra.

- Dìm ngập khay có gel trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần (đệm TAE cung cấp ion cho điện trường hoạt động).

- Tra mẫu: Lấy 10 l sản phẩm PCR mỗi loại, trộn với 2 l chất chỉ thị tra mẫu (loading dye 3X) (thành phần chủ yếu là xanh Bromophenol) với mẫu và tra riêng biệt vào từng lỗ giếng trong bản gel.

- Tra chỉ thị phân tử (Marker): Trong 1 giếng riêng biệt khác cho 10l (0.5g) chỉ thị phân tử (thường dùng: DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt

bằng enzym giới hạn HindIII).

- Chạy điện di ở 100V trong 20 phút.

- Phát hiện DNA của sản phẩm: Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (2g/ml; 15 l/bản gel), lắc đều trên máy lắc trong 10 phút.

- Rửa gel bằng nước cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh bằng máy Dolphin-Doc (WEALTEC, USA).

2.4.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh s ạch bằng bộ k ít của Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kít) theo qui trình như sau:

Bước 1: Thêm 150 µl dung dịch PB vào ống Eppendorf chứa 30 µl sản phẩm PCR còn lại sau điện di kiểm tra sản phẩm PCR với tỷ lệ 5 : 1, trộn đều bằng pipet cho dung dịch PB tiếp xúc hoàn toàn với sản phẩm PCR trong hỗn dịch.

Bước 2: Chuyển toàn bộ dung dịch trên sang cột có màng lọc đặt trong ống hứng, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ dung dịch dưới. Khi ly tâm DNA của sản phẩm PCR mang điện tích âm được giữ lại trong màng lọc điện tích dương theo cơ chế tích điện.

Bước 3: Rửa màng lọc có DNA của PCR bằng cách cho 750 µl dung dịch

PElên trên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, rồi bỏ dịch dưới. Ly

tâm lại lần hai đảm bảo cho màng chứa DNA của PCR thật khô.

Bước 4: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, bổ sung 30 µl dung

dịch EB lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, đem ly tâm 13000

vòng/phút trong 2 phút, sau đó bỏ cột. DNA của PCR sẽ tách khỏi màng lọc cùng với dung dịch EB và chúng ta thu được mẫu DNA đã được tinh sạch.

Ký hiệu mẫu và bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng.

2.4.4. Phƣơng pháp tạo dòng sản phẩm PCR

2.4.4.1 Tạo vectơ tái tổ hợp

Sản phẩm phản ứng PCR sẽ được gắn vào vector pCR 2.1 - TOPO (Hình

2.2) theo phương pháp dòng hóa TA (TA - cloning) của hãng Invitrogen , có enzym topoisomerase làm enzym nối . Nguyên lý của quá trình tái tổ hợp này là :

Do sản phẩm PCR thông thường được gắn thêm Adenine (A) vào đầu cuối 3’, vì

có sử dụng enzym Taq , nên khi nối với vector pCR 2.1 có đầu lồi Thymine (T) đã được hãng Invitrogen thiết kế từ trước , thì hai nucleotide này sẽ gắn nối bổ sung cho nhau.

Hình 2.2. Cấu trúc vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen)

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng

Tên hóa chất Thể tích (µl)

Nước tinh khiết 3

DNA khuôn 1

Vector TOPO pCR2.1 1

Salt solution 1