Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR

2.4.3.1 Thiết kế mồi

Dùng phương pháp truy cập Ngân hàng gen [GenBank (http://www. ncbi.nlm.nih.gov)], để tìm kiếm tất cả các chuỗi nucleotid hiện có của tất cả các

chủng/týp thuộc họ Papillomavirus và Epstein-Barr Virus đã được đăng ký cho

đến hiện nay.

Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR:

- Thiết kế cặp mồi cho gen E6 của HPV-16 chúng tôi chọn cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn DNA vùng "siêu biến đổi" thuộc gen E6 bằng phản ứng PCR, dựa trên cơ sở các trình tự bảo tồn của gen E6, gồm mồi xuôi E6F và mồi ngược E6R.

E6F: 5-CAAGCAACAGTTACTGCGA-3

E6R: 5-CAACAAGACATACATCGACC-3.

Sản phẩm PCR thu được có độ dài là 321 bp.

- Thiết kế cặp mồi cho HPV-18 chúng tôi đã chọn cặp mồi (primer) đặc

hiệu để nhân bản DNA đích của HPV-18 bằng phản ứng PCR dựa trên cơ sở các trình tự bảo tồn của gen L1, gồm mồi xuôi HP18F và mồi ngược HP18R. Trình tự cặp mồi cho HPV-18 là:

HP18F: 5'- AGGCACAGGGTCATAACAATGG -3'; HP18R: 5'- CGCTTGGCAGGTTTAGAAGACG -3'. Sản phẩm PCR thu được có độ dài là 556 bp.

- Thiết kế cặp mồi cho EBNA-1 chúng tôi đã chọn cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn DNA gen EBNA-1 có vai trò chủ đạo trong chu kỳ tái tạo, nhân lên và gây bệnh của EBV. Các trình tự tương ứng với đoạn DNA nghiên cứu từ

một số chủng/týp thuộc Epstein-Barr Virus đã được đăng ký tại Ngân hàng Gen

vùng nói trên được nhân lên bằng phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi (primer pairs) bám vào gen EBNA-1, như sau:

EBK1F: 5’-GTCATCATCATCCGGGTCTC-3’ EBV1R: 5’ -CGATTGAGGGCGTCTCCTAAC- 3’

Sản phẩm PCR thu nhận đoạn gen EBNA-1 có độ dài khoảng 800 bp.

2.4.3.2 Quy trình phản ứng PCR

DNA tổng số thu được được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, với

hàm lượng DNA sử dụng cho mỗi phản ứng PCR (dung tích 50 l) là khoảng

100-150 nanogam (ng).

Với cặp mồi E6F - E6R, đoạn DNA nhân lên bằng PCR có độ dài 321 bp, với đối tượng nhân lên trong phản ứng PCR là đoạn gen E6 của HPV-16. Với cặp mồi HP18F- HP18R, đoạn DNA nhân lên bằng PCR có độ dài 556 bp, với đối tượng nhân lên trong phản ứng PCR là đoạn gen L1 của HPV-18. Hai cặp mồi này (E6F- E6R/HP18F- HP18R), được phối hợp thực hiện multiplex-PCR trong một phản ứng sử dụng một nguồn khuôn DNA tổng số tách từ mẫu bệnh phẩm. Nếu trong khuôn DNA chỉ có một loại HPV-16 hoặc HPV-18 thì chỉ có 1 băng DNA tương ứng mỗi loại được hình thành, nếu song nhiễm cả hai loại thì sẽ có khả năng có cả 2 băng DNA được thu nhận, hàm lượng DNA sản phẩm PCR phụ thuộc vào lượng khuôn DNA của mỗi loại tùy theo mức độ nhiễm virus.

Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR như sau:

Bảng 2.1. Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng multiplex-PCR HPV-16/HPV-18. Thành phần Thể tích PCR MM 25µl E6F (5pmol/µl) 1 µl E6R (5pmol/µl) 1 µl HP18R(5pmol/µl) 1 µl HP18F(5pmol/µl) 1 µl

Khuôn DNA 2 µl

DMSO 2,5 µl

H20 16,5 µl

Tổng số 50 µl

Phản ứng multiplex-PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng multiplex - PCR HPV16/HPV18

Nhiệt độ Thời gian (phút) Số chu kỳ

95oC 5 1 95oC 1 35 48oC 1 72oC 3 72oC 10 1

4oC Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm phản ứng

- Với cặp mồi EBK1F - EBVR, PCR cho phép nhân lên đoạn DNA có độ dài khoảng 800 bp. Đối tượng nhân lên trong phản ứng PCR là: Đoạn gen EBNA-1. DNA tổng số thu được ở bước trên, được dùng làm khuôn cho phản

ứng PCR. Hàm lượng DNA sử dụng cho mỗi phản ứng PCR (50 l) là khoảng

100 - 150 nanogam (ng). Phối hợp các thành phần tham gia phản ứng PCR được trình bày ở Bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR gen E6 của HPV-16 Thành phần Thể tích (µl) PCR master mix 25 Khuôn DNA (~10 - 50 ng) 2 E6 F (10 pmol/ul) 1 E6 R (10 pmol/ul) 1 DMSO 2,5

Nước tinh khiết 18,5

Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR của gen EBNA-1

Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản trước khi tinh

sạch, bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng (giải trình tự trực tiếp) hoặc nếu cần

thiết tiến hành dòng hoá vào vector để giải trình tự.

2.4.3.3 Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR nói chung được phát hiện khi điện di trên thạch (gel) agarose 0.8-2%. Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc độ khác nhau; Loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn. Agarose được chiết suất từ tảo biển, có

thể mua ở dạng bột khô. Nó bị nóng chảy ở nhiệt độ trên 45C, trong dung dịch

đệm ở nồng độ thích hợp. Khi làm nguội (dưới 45C), agarose đông lại thành

gel. Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó. Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại. Kích thước các băng DNA

Nhiệt độ Thời gian (phút) Số chu kỳ

94oC 5 1 94oC 1 35 580C 1 72oC 1 72oC 10 1

được so sánh với chỉ thị di truyền (DNA marker) được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt.

Cách tiến hành như sau:

- Chuẩn bị gel agarose 0.8% (thường được dùng nhiều nhất): Lấy 0.32g thạch agarose nguyên chất, cho vào cốc đong thuỷ tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40ml đệm TAE 1 lần (1xTAE). Cho vào lò vi sóng, đặt nóng chảy trong 3 phút

sao cho agarose tan chảy hết. Đổ thạch đã tan chảy (nhiệt độ 550

C- 600C) vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng vào (tuỳ theo cần bao nhiêu mẫu mà bố trí lược có 4, 8 hay 15 răng) và đổ ngập răng lược khoảng 0.5 cm và để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi nguội (sau 60-120 phút), các răng lược sẽ tạo thành các giếng để chúng ta cho sản phẩm PCR vào kiểm tra.

- Dìm ngập khay có gel trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần (đệm TAE cung cấp ion cho điện trường hoạt động).

- Tra mẫu: Lấy 10 l sản phẩm PCR mỗi loại, trộn với 2 l chất chỉ thị tra mẫu (loading dye 3X) (thành phần chủ yếu là xanh Bromophenol) với mẫu và tra riêng biệt vào từng lỗ giếng trong bản gel.

- Tra chỉ thị phân tử (Marker): Trong 1 giếng riêng biệt khác cho 10l (0.5g) chỉ thị phân tử (thường dùng: DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt

bằng enzym giới hạn HindIII).

- Chạy điện di ở 100V trong 20 phút.

- Phát hiện DNA của sản phẩm: Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (2g/ml; 15 l/bản gel), lắc đều trên máy lắc trong 10 phút.

- Rửa gel bằng nước cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh bằng máy Dolphin-Doc (WEALTEC, USA).

2.4.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh s ạch bằng bộ k ít của Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kít) theo qui trình như sau:

Bước 1: Thêm 150 µl dung dịch PB vào ống Eppendorf chứa 30 µl sản phẩm PCR còn lại sau điện di kiểm tra sản phẩm PCR với tỷ lệ 5 : 1, trộn đều bằng pipet cho dung dịch PB tiếp xúc hoàn toàn với sản phẩm PCR trong hỗn dịch.

Bước 2: Chuyển toàn bộ dung dịch trên sang cột có màng lọc đặt trong ống hứng, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ dung dịch dưới. Khi ly tâm DNA của sản phẩm PCR mang điện tích âm được giữ lại trong màng lọc điện tích dương theo cơ chế tích điện.

Bước 3: Rửa màng lọc có DNA của PCR bằng cách cho 750 µl dung dịch

PElên trên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, rồi bỏ dịch dưới. Ly

tâm lại lần hai đảm bảo cho màng chứa DNA của PCR thật khô.

Bước 4: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, bổ sung 30 µl dung

dịch EB lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, đem ly tâm 13000

vòng/phút trong 2 phút, sau đó bỏ cột. DNA của PCR sẽ tách khỏi màng lọc cùng với dung dịch EB và chúng ta thu được mẫu DNA đã được tinh sạch.

Ký hiệu mẫu và bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng.

2.4.4. Phƣơng pháp tạo dòng sản phẩm PCR

2.4.4.1 Tạo vectơ tái tổ hợp

Sản phẩm phản ứng PCR sẽ được gắn vào vector pCR 2.1 - TOPO (Hình

2.2) theo phương pháp dòng hóa TA (TA - cloning) của hãng Invitrogen , có enzym topoisomerase làm enzym nối . Nguyên lý của quá trình tái tổ hợp này là :

Do sản phẩm PCR thông thường được gắn thêm Adenine (A) vào đầu cuối 3’, vì

có sử dụng enzym Taq , nên khi nối với vector pCR 2.1 có đầu lồi Thymine (T) đã được hãng Invitrogen thiết kế từ trước , thì hai nucleotide này sẽ gắn nối bổ sung cho nhau.

Hình 2.2. Cấu trúc vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen)

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng

Tên hóa chất Thể tích (µl)

Nước tinh khiết 3

DNA khuôn 1

Vector TOPO pCR2.1 1

Salt solution 1

Tổng thể tích 6

2.4.4.2. Biến nạp

Vectơ tái tổ hợp được đưa vào tế bào E. coli chủng DH 5α bằng một quá

trình gọi là biến nạp. Đó là quá trình tạo cho plasmid đã được gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên qua màng vào trong nguyên sinh chất. Khi đã được biến nạp, plasmid (có thể tái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môi trường dinh dưỡng thích hợp.

Quy trình biến nạp nhƣ sau:

DH 5α, rồi ủ trong đá lạnh (0- 4C) trong 35- 45 phút, cho plasmid xuyên qua

màng biến nạp vào tế bào. Sau đó hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 42C trong 45

giây và ngay lập tức chuyển vào ủ trên đá lạnh trong 2 phút. Cho vào hỗn dịch

tế bào nói trên 250 l môi trường dinh dưỡng có tên gọi là SOC [thành phần:

Trypton (20 g/l); dịch chiết nấm men (5 g/l); NaCl (10 mM); KCl (2.5 mM);

MgCl2 (10 mM); MgSO4 (10 mM) và glucose (20 mM)]. Toàn bộ hỗn hợp này

được lắc 220 vòng /phút ở nhiệt độ 37C trong 1 giờ để vi khuẩn tái tổ hợp nhân

lên trong vài chu kỳ sinh trưởng và phát triển. Lấy khoảng 100- 150 l của toàn

bộ hỗn hợp sau khi nuôi 1 giờ này dàn đều trên mặt thạch (LB agar 1,5%) có

chứa kháng sinh Kanamycin và X -gal và ủ ở 37C trong 18- 20 giờ.

2.4.4.3. Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp

Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng hai phương pháp: chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X -gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn không biến nạp thành công vectơ tái tổ hợp, và chọn lọc theo phương pháp kháng sinh (Kanamycin hoặc Ampicillin) nhằm loại trừ những vi khuẩn không biến nạp được bất kỳ vectơ nào và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác.

+ Theo cơ chế X -gal

Chọn những khuẩn lạc có màu trắng mang vectơ tái tổ hợp, không chọn

những khuẩn lạc có màu xanh. Vi khuẩn E. coli không chứa plasmid tái tổ hợp

thì sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản xuất enzym -galactosidase và sẽ phân huỷ cơ

chất X -gal có trong môi trường tạo nên dẫn xuất indol, dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hoá cho màu xanh. Nếu có đoạn DNA ngoại lai (ở đây là DNA

vùng siêu biến đổi) xen vào giữa gen lacZ thì gen này sẽ bị bất hoạt, enzym -

galactosidase không được sản xuất, vì thế mặc dù có X -gal trong môi trường, nhưng cơ chất này không bị phân huỷ, không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng. Chọn những khuẩn lạc có màu trắng ngà là tốt nhất.

+ Theo cơ chế kháng sinh

Tế bào E. coli nguyên thuỷ, không tiếp nhận được plasmid tái tổ hợp khi nuôi cấy trên thạch cho dù có X -gal hay không, nếu không có kháng sinh ức chế, chúng vẫn phát triển thành khuẩn lạc có màu trắng và dễ nhầm lẫn với khuẩn lạc của vi khuẩn tái tổ hợp. Do vậy người ta phải dùng kháng sinh (Kanamycin và /hoặc Ampicillin) để loại trừ chúng. Chúng sẽ bị kháng sinh tiêu diệt, còn vi khuẩn tiếp nhận plasmid pCR2.1 (tái tổ hợp hoặc không tái tổ hợp) có chứa gen sản xuất enzym phá huỷ kháng sinh nên tồn tại và phát triển thành khuẩn lạc.

Cách tiến hành (thực hiện trong buồng cấy vô trùng Laminair)

- Khuẩn lạc màu trắng trên môi trường LB agar được lựa chọn nuôi cấy trong các ống chứa 5 ml môi trường LB [Bactotryptone hoặc casein hydrolysate (10g/l), dịch chiết nấm men (5 g/l) và NaCl (10g/l)], khoảng 10ml nước thịt /ống.

- Bổ sung 5 µl Kanamycin nồng độ là khoảng 50 g/ml để chọn lọc dòng

có mang gen kháng kháng sinh.

- Có thể bổ sung thêm X-gal vào môi trường để loại bỏ những ống môi trường có màu xanh (do đoạn gen chưa gài vào vector) mà khi chọn lọc khuẩn lạc bị lẫn tạp hoặc khi chọn lọc khuẩn lạc có nhân hơi xanh.

- Sau khi cấy khuẩn lạc, ống môi trường được lắc 200 vòng/phút trong 16

– 20 giờ ở 370C cho vi khuẩn nhân lên.

2.4.4.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp

Trong vi khuẩn tái tổ hợp sẽ có 2 hệ gen được nhân lên: hệ gen của chính vi khuẩn chủ, và hệ gen của plasmid tái tổ hợp. Tách DNA plasmid tái tổ hợp nghĩa là thu nhận hệ gen của plasmid và loại trừ hệ gen vi khuẩn chủ mà chúng ta không cần.

Sử dụng bộ hóa chấ t tách chiết plasmid tái tổ hợp của hãng Bioneer (AccuPrep™ Plasmid Mini Extraction Kit) được sử dụng hiện nay . Tách chiết

DNA plasmid được thực hiện nhờ các dung dịch có khả năng làm ly giải tế bào vi khuẩn, loại bỏ DNA hệ gen vi khuẩn khỏi DNA plasmid bằng các loại muối vô cơ có trong dung môi của bộ kít. Sau đó dung dịch chứa DNA palsmid được chuyển sang cột lọc , có cấu tạo màng lọc tích điện dương (+), chỉ giữ lại DNA plasmid tích điện âm (-), qua nhiều lần ly tâm

Các bước tiến hành tách DNA plasmid tái tổ hợp (phương pháp của Hãng sinh phẩm Bioneer)

Bước 1: Chuyển dịch nuôi cấy ở trên sang ống Eppendorf 1,5 ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế bào. Sau ly tâm bỏ dịch bên trên, giữ cặn tế bào bên dưới (dùng pipet hút hết dịch trong giữ lại cặn tế bào).

Bước 2: Thêm 250 µl dung dịch (1) vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho đều.

Bước 3: Thêm 250 µl dung dịch (2) vào hỗn dịch trên để phá màng tế bào, đậy nắp, nhẹ nhàng trộn bằng cách lắc xuôi ngược toàn bộ vài lần.

Bước 4: Thêm 350 µl dung dịch (3), trộn nhẹ nhàng, sau đó đem ly tâm ở

13000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 40

C.

Bước 5: Chuyển toàn bộ phần dịch trong bên trên lên trên màng của cột lọc. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới.

Bước 6: Thêm 500 µl dung dịch (D) lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 5 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới.

Bước 7: Thêm 700 µl dung dịch (4) lên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới. Ly tâm lại để làm khô cột.

Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µl dung dịch (5) lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc và thu được dịch chứa DNA plasmid ở dưới.

Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200

2.4.4.5. Kiểm tra DNA tái tổ hợp

DNA ngoại lai là sản phẩm của PCR được tạo dòng vào plasmid pCR2.1 sẽ được plasmid nhân lên trong tế bào E. coli và được tách chiết như đã giới