a. Nguyên tắc
Trong công trình này chúng tôi sử dụng kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAGEN. Nguyên tắc là dựa vào khả năng bám của DNA lên màng silica trong ống tinh sạch khi có mặt nồng độ cao các muối chatropic ở pH <7,5. Đệm QG giúp hoà tan gel và tạo điều kiện các thành phần này. DNA sau đó sẽ đƣợc thôi ra khỏi màng bằng đệm thôi EB thuận lợi để DNA bám lên màng. Sự bám DNA lên màng có tính đặc hiệu nên những thành phần khác không đƣợc giữ lại, đệm rửa PE sẽ loại hoàn toàn.
b. Tiến hành
Bƣớc 1: Cắt phần gel agarose có DNA nghiên cứu
- Sau khi soi dƣới tia UV λ 360 nm bản gel đã nhuộm bằng Ethidium Bromide, cắt lấy băng của mẫu DNA nghiên cứu. Đặt miếng gel vào ống đã xác định trƣớc khối lƣợng. Xác định khối lƣợng miếng gel đã cắt. Bƣớc 2: Gắn DNA lên màng silica
- Bổ sung đệm QG theo tỉ lệ thể tích 300 μl/100 mg gel.
- Ủ hỗn hợp phản ứng ở 50°C trong 10 phút tới khi mảnh gel tan hoàn toàn, trong quá trình ủ đảo nhẹ ống 2-3 lần.
- Kiểm tra đảm bảo dung dịch sau khi ủ có màu vàng (chứng tỏ pH < 7,5 pH phù hợp để gắn DNA lên màng). Nếu dung dịch có màu cam hay tím, thêm 10 μl sodium acetate pH= 5 để dung dịch chuyển sang vàng. - Bổ sung isopropanol tỉ lệ 100 μl isopropanol/100 mg gel.
- Chuyển dung dịch sang cột đã đặt sẵn trong ống 2 mL sạch , ly tâm 1 phút. Loại dịch ly tâm.
- Bổ sung 0,5 mL đệm QG vào cột, ly tâm 1 phút. Bƣớc 3: Loại bỏ các thành phần không gắn lên màng sillica
- Thêm 0,75 mL đệm rửa PE vào cột, ly tâm 1 phút.
- Loại dịch ly tâm, ly tâm tiếp trong 1 phút. Chuyển cột vào Eppendorf 1,5 mL sạch.
Bƣớc 4: “Thôi” DNA ra khỏi màng sillica - Bổ sung 50 μl nƣớc khử ion, vô khuẩn. - Ly tâm 1 phút, thu dịch trong Eppendoff.
Các bƣớc ly tâm đều đƣợc thực hiện ở tốc độ 12000 vòng/phút, ủ ở nhiệt độ phòng.
- Cắt bản gel chứa DNA với kích thƣớc nhỏ nhất vào ống eppendorf. - Thêm vào 400 µL dung dịch QC, lắc đều, ủ 56oCtrong 10 phút để gel tan hoàn toàn.
- Thêm vào 10 µL 3M Sodium acetat, trộn đều.
- Thêm vào 350 µL isopropanol, lắc đều không ly tâm.
- Cho dung dịch chứa Isopropanol, DNA, Sodium acetat, QC vào giữa cột QIA quick colum, ly tâm 10.000 vòng/1 phút, đổ dịch phía dƣới cột thu tủa.
- Thêm 500 µL dung dịch QG vào giữa cột, ly tâm 10.000 vòng/1 phút, đổ dịch phía dƣới cột thu tủa.
- Thêm 750 µL dung dịch PE vào giữa cột, ly tâm 10.000 vòng/ 1 phút để loại hết buffer, chuyển cột sang ống 1,5 mL.
- Thêm 20 µL nƣớc cất vào giữa ống để 5 phút, ly tâm 10.000 vòng/ 1 phút thu DNA. 2.3.8. Giải trình tự gen 2.3.8.1. Phản ứng giải trình tự + Chu trình nhiệt: 96 oC /1 phút 94 oC /10 giây 50 oC /5 giây 25 chu kỳ 60 oC /4 phút 4 oC /∞ + Thành phần của phản ứng: Thành phần Thể tích (µL) Terminator ready 8 Mẫu PCR 2
10 pmol mồi xuôi 0,4
Nƣớc cất 9,6
Tổng số 20
2.3.8.2. Tinh sạch sản phẩm
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự:
- Thêm 45 µL SAM solution vào ống PCR.
- Bổ sung 10 µL Terminator Sol, lắc đều ở 9.000 vòng/phút trong 30 phút.
2.3.8.3. Giải trình tự gen
Theo qui trình của Matsuo và cs. Trình tự nucleotid của mẫu nghiên cứu với trình tự nucleoti của Genbank để xác định đột biến bằng phần mềm FÁTA để xác định đột biến, và so sánh với trình tự acidamin của Genbank bằng phần mềm Translate để xác định đột biến.
2.3.9. Phân tích tiền sử gia đình của các bệnh nhân
* Việc phân tích tiền sử gia đình đƣợc thực hiện ở các gia đình bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình nhằm tìm ra những thành viên có nguy cơ mắc bệnh cao vì đây là bệnh lý di truyền:
* Minh họa gia đình có tiền sử bị bệnh ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình (gia đình số 1):
3 1 1 2 4 1
Nam bình thƣờng Nam bị bệnh Nam bị bệnh ung thƣ đại
trực tràng đã tử vong
Nữ bình thƣờng Nữ bị bệnh Nữ bị bệnh ung thƣ đại
trực tràng đã tử vong
là bệnh nhân và thành viên gia đình đƣợc tiến hành nghiên cứu
I
II
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc tiến hành dựa trên sự tự nguyện tham gia của các gia đình có bệnh nhân bị ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình trên lâm sàng và giải phẫu bệnh. Các xét nghiệm phân tích gen chỉ thực hiện khi có sự đồng ý của bệnh nhân và ngƣời nhà bệnh nhân. Đối tƣợng nghiên cứu sẽ đƣợc nhận tiền bồi dƣỡng cho quá trình đi lại, khám và lấy máu, hoàn toàn miễm phí các xét nghiệm phân tích gen.
Các thông tin về bệnh nhân và ngƣời nhà bệnh nhân, kết quả chẩn đoán đƣợc hoàn toàn giữ bí mật. Nghiên cứu đƣợc tiến hành hoàn toàn vì mục đích khoa học, không vì bất kỳ mục đích nào khác.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả tách chiết DNA
DNA của các bệnh nhân, các thành viên gia đình bệnh nhân cùng các mẫu đối chứng đƣợc tách chiết theo quy trình phenol/chlororform. Sau khi tách chiết, các mẫu DNA đƣợc kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch bằng phƣơng pháp đo mật độ quang.
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch các mẫu DNA tách từ máu ngoại vi của các bệnh nhân và thành viên gia đình bệnh nhân
Gia đình (Mã số) Nồng độ DNA (ng/µL) Độ tinh sạch (A260/A28 0) Mã số BN Nồng độ DNA (ng/µL) Độ tinh sạch (A260/A280) Gia đình (Mã số) Nồng độ DNA (ng/µL) Độ tinh sạch (A260/A280) 1 (II.4) 450 1,78 6 (II.6) 285 1,85 11 (II.4) 285 1,8 1 (III.1) 380 1,82 6 (II.7) 290 1,8 11 (III.1) 305 1,82
2 (II.3) 320 1,8 6 (III.1) 360 1,85 12 (II.2) 320 1,83 2 (III.1) 315 1,82 6 (III.2) 327 1,8 12 (III.1) 326 1,8
3 (II.3) 336 1,8 7 (II.2) 315 1,81 12 (III.2) 350 1,84 3 (III.2) 318 1,8 7 (III.1) 285 1,8 13 (II.3) 298 1,82 4 (II.1) 420 1,8 8 (II.4) 342 1,84 13 (III.1) 307 1,81 4 (III.1) 350 1,8 8 (III.1) 308 1,87 13 (III.2) 278 1,8 4 (III.2) 310 1,8 8 (III.2) 286 1,85 14 (II.2) 296 1,82 5 (III.3) 280 1,8 8 (III.3) 290 1,83 14 (III.1) 320 1,78 5 (III.1) 335 1,82 9 (II.2) 275 1,9 14 (III.2) 297 1,8 5 (III.2) 370 1,8 9 (III.1) 280 1,87 15 (II.3) 286 1,82
6 (II.2) 360 1,75 9 (III.2) 312 1,84 15 (III.1) 275 1,83 6 (II.3) 310 1,81 10 (II.2) 296 1,81 15 (III.2) 308 1,84 6 (II.4) 342 1,83 10 (III.1) 300 1,82 15 (III.3) 310 1,8 6 (III.5) 340 1,8 10 (III.2) 321 1,85
Nhận xét:
Kết quả đo quang cho thấy tất cả các mẫu DNA đều có hàm lƣợng cao đủ cho các thí nghiệm tiếp theo và độ tinh sạch cao với tỷ số mật độ quang ở bƣớc sóng 260/280 luôn nằm trong khoảng 1,8 - 1,9.
Các mẫu DNA sau khi tách chiết và tinh sạch đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại exon 15 của gen APC với các cặp mồi ở bảng 2.1. Sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc sử dụng để xác định trình tự nucleotid.
3.2. Kết quả xác định đột biến gen APC ở các gia đình bệnh nhân
ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình
Các mẫu máu của bệnh nhân đƣợc thu nhận, tách chiết DNA và xác định đột biến (xem phần phƣơng pháp). Trong số 15 gia đình bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình, chúng tôi đã phát hiện đƣợc các đột biến dịch khung (thêm, mất nucleotid) và đột biến thay thế nucleotid. Kết quả phân tích các bệnh nhân cụ thể nhƣ sau:
1. Kết quả phân tích gen APC ở gia đình số 1
Cây phả hệ gia đình số 1
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 1A
M II.4 III.1 Chứng
Hình 3.1. Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 1A ở exon 15 của gen APC M: thang DNA chuẩn 100 bp
Nhận xét: Cặp mồi 1A cho phép khuếch đại đoạn gen với kích thƣớc 526 bp bao phủ từ codon 649-824 của gen APC, kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR là đặc hiệu chỉ có một băng sáng, rõ nét và kích thƣớc khoảng 500 bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc đoạn gen theo lý thuyết.
3
1 1 2
4 1
Nam bình thƣờng Nam bị bệnh Nam bị bệnh ung thƣ đại
trực tràng đã tử vong
Nữ bình thƣờng Nữ bị bệnh Nữ bị bệnh ung thƣ đại
trực tràng đã tử vong
là bệnh nhân và thành viên gia đình đƣợc tiến hành nghiên cứu
I
II III
Trong gia đình số 1, yếu tố di truyền của bệnh ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình thể hiện rất rõ (bố, hai anh trai và chị gái của bệnh nhân đều đã tử vong vì bệnh), bệnh nhân (II.4) và con bệnh nhân (III.1) đều đã biểu hiện bệnh ung thƣ ĐTT thể FAP. Kết quả giải trình tự cho thấy, hai mẹ con bệnh nhân đều mang gen APC đột biến giống nhau.
Kết quả giải trình tự CCCT ins Mẫu chứng Bệnh nhân Con bệnh nhân CCCT ins CCCT ins Mẫu chứng Bệnh nhân Con bệnh nhân CCCT ins
Hình 3.2. Hình ảnh giải trình tự đột biến đột biến thêm 4 nucleotid c.2086-2090CCCTinsở gia đình số 1 (dị hợp tử)
Hình 3.3. Hình ảnh giải trình tự đột biến đột biến xóa 4 nucleotid c.2148-2152AGCAdel ở gia đình số 1 (dị hợp tử)
Nhận xét:
Đột biến thêm 4 nucleotid c.2086-2090CCCTins và mất 4 nucleotid c.2148-2152AGCAdeltạo đột biến dịch khung đọc và tạo mã kết thúc (X) ở vị trí 679 (p.Asn679X) đều xuất hiện ở mẹ (II.4) và con (III.1) đã biểu hiện bệnh ung thƣ đại trực tràng thể FAP. Thành phần acid amin bị thay đổi nhiều trên chuỗi polypeptid.
Con bệnh nhân
AGCA del
AGCA del
Bệnh nhân Mẫu chứng
Kết quả phân tích gen APC ở bệnh nhân II.4 khi so sánh với trình tự nucleotid trong ngân hàng gen (genbank):
>>EM_HUM:M74088; M74088 Human APC gene mRNA, complete cd (8972 nt) initn: 212 init1: 173 opt: 301 Z-score: 156.1 bits: 42.6 E(): 0.35
banded Smith-Waterman score: 301; 69.7% identity (69.7% similar) in 145 nt overlap (351-491:1977-2117) 330 340 350 360 370 380 Sequen ACCTTAATTGAGTGATCTCTTGAATTTCTTGCAAATCCTACCAGAGAACAACTGTCTACC :::: ::::: : :::: ::::: :: : EM_HUM CAGCTTGATAGCTACAAATGAGGACCACAGGCAAATCCTAAGAGAGAACAACTGTCTACA 1950 1960 1970 1980 1990 2000 390 400 410 420 430 440 Sequen AACTTTATTACTACCCTCACTAACAATCTCATAGTTTGACAATAGTCAGTAATGCATGTG :::: :::: : :::: : ::: ::: : : ::::::::: : :::: ::: : EM_HUM AACTTTATTACAA----CACTTAAAATCTCATAGTTTGACAATAGTCAGTAATGCATGTG 2010 2020 2030 2040 2050 2060 450 460 Sequen TAACTTTGTGGAATCTCTC----AGAAA :::::::::::::::::: ::::: EM_HUM GAACTTTGTGGAATCTCTCAGCAAGAAA 2070 2080 2090
2. Kết quả phân tích gen APC ở gia đình số 7
Cây phả hệ gia đình số 7 1 2 1 3 1
Nam bình thƣờng Nam bị bệnh Nam bị bệnh KĐTT đã
tử vong
Nữ bình thƣờng Nữ bị bệnh
là bệnh nhân và thành viên gia đình đƣợc tiến hành nghiên cứu
CCCT ins
AGCA del
I
II
Gia đình số 7 có 3 thành viên đã biểu hiện bệnh. Phân tích đột biến gen
APC ở bệnh nhân II.2 và con bệnh nhân chƣa biểu hiện ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình. Kết quả phân tích cho thấy con bệnh nhân có mang gen đột biến giống với bệnh nhân (hình 3.5).
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 2C
M II.3 III.1 Chứng
Hình 3.4. Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 2C ở exon 15 của gen APC M: thang DNA chuẩn 100 bp
Nhận xét:
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR là đặc hiệu chỉ có một băng sáng, rõ nét và kích thƣớc khoảng 500 bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc đoạn gen của exon 15 theo lý thuyết là 536 bp .
Kết quả giải trình tự
Con bệnh nhân III.1 Mẫu chứng
Bệnh nhân II.2 A del
A del
Con bệnh nhân III.1 Mẫu chứng
Bệnh nhân II.2 A del
A del
Hình 3.5. Hình ảnh giải trình tự đột biến đột biến xóa 1 nucleotid c.3407Adelở gia đình số 5.
Nhận xét:
Đột biến mất 1 nucleotid c.3407Adelgặp ở bệnh nhân II.2 và con bệnh nhân (III.1).
Kết quả phân tích gen APC ở bệnh nhân II.2 khi so sánh với trình tự nucleotid trong ngân hàng gen (genbank):
>>EM_HUM:M74088; M74088 Human APC gene mRNA, complete cd (8972 nt)
initn: 1855 init1: 1855 opt: 1937 Z-score: 1721.9 bits: 331.9 E(): 2.2e-88 banded Smith-Waterman score: 1937; 99.7% identity (99.7% similar) in 392 nt overlap (1-391:3320-3711) 10 20 Sequen CATACAGGTCACGGGGAGCC-ATGGTTCAG :::::::::::::::::::: ::::::::: EM_HUM CACATTTTGGACAGCAGGAATGTGTTTCTCCATACAGGTCACGGGGAGCCAATGGTTCAG 3290 3300 3310 3320 3330 3340 30 40 50 60 70 80 Sequen AAACAAATCGAGTGGGTTCTAATCATGGAATTAATCAAAATGTAAGCCAGTCTTTGTGTC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM AAACAAATCGAGTGGGTTCTAATCATGGAATTAATCAAAATGTAAGCCAGTCTTTGTGTC 3350 3360 3370 3380 3390 3400 90 100 110 120 130 140 Sequen AAGAAGATGACTATGAAGATGATAAGCCTACCAATTATAGTGAACGTTACTCTGAAGAAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM AAGAAGATGACTATGAAGATGATAAGCCTACCAATTATAGTGAACGTTACTCTGAAGAAG 3410 3420 3430 3440 3450 3460 150 160 170 180 190 200 Sequen AACAGCATGAAGAAGAAGAGAGACCAACAAATTATAGCATAAAATATAATGAAGAGAAAC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM AACAGCATGAAGAAGAAGAGAGACCAACAAATTATAGCATAAAATATAATGAAGAGAAAC 3470 3480 3490 3500 3510 3520 210 220 230 240 250 260 Sequen GTCATGTGGATCAGCCTATTGATTATAGTTTAAAATATGCCACAGATATTCCTTCATCAC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM GTCATGTGGATCAGCCTATTGATTATAGTTTAAAATATGCCACAGATATTCCTTCATCAC 3530 3540 3550 3560 3570 3580 270 280 290 300 310 320 Sequen AGAAACAGTCATTTTCATTCTCAAAGAGTTCATCTGGACAAAGCAGTAAAACCGAACATA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM AGAAACAGTCATTTTCATTCTCAAAGAGTTCATCTGGACAAAGCAGTAAAACCGAACATA 3590 3600 3610 3620 3630 3640 330 340 350 360 370 380 Sequen TGTCTTCAAGCAGTGAGAATACGTCCACACCTTCATCTAATGCCAAGAGGCAGAATCAGC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM TGTCTTCAAGCAGTGAGAATACGTCCACACCTTCATCTAATGCCAAGAGGCAGAATCAGC 3650 3660 3670 3680 3690 3700
Nhận xét: Đột biến mất 1 nucleotid c.3407Adelgặp ở gia đình số 7 gây dịch khung đọc trên chuỗi polypeptid và tạo mã kết thúc (X) ở vị trí codon 1125 (p.Val1125X ).
3.Kết quả phân tích gen APC ở gia đình số 9
Cây phả hệ gia đình số 9
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3C
M II.2 III.1 III.2 Chứng
Hình 3.6. Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 3C ở exon 15 của gen APC M: thang DNA chuẩn 100 bp
Nhận xét: Cặp mồi 3C cho phép khuếch đại đoạn gen có kích thƣớc 536 bp bao phủ từ codon 1420-1598. Sản phẩm PCR thu đƣợc rõ nét với một vạch duy nhất kích thƣớc khoảng 500 bp phù hợp với kích thƣớc đoạn gen lý thuyết.
2
1 2 1
536 bp
Nam bình thƣờng Nam bị bệnh Nam bị bệnh KĐTT đã
tử vong
Nữ bình thƣờng Nữ bị bệnh
là bệnh nhân và thành viên gia đình đƣợc tiến hành nghiên cứu
I
II
III
Kết quả giải trình tự A ins Mẫu chứng Bệnh nhân II.2 Con BN III.1 Con BN III.2 A ins A ins Mẫu chứng Bệnh nhân II.2 Con BN III.1 Con BN III.2 A ins
Hình 3.7. Hình ảnh giải trình tự đột biến thêm 1 nucleotid c.4463Ains ở gia đình số 9
Kết quả phân tích gen APC ở bệnh nhân II.2 khi so sánh với trình tự nucleotid trong ngân hàng gen (genbank):
>>EM_HUM:M74088; M74088 Human APC gene mRNA, complete cd (8972 nt) initn: 2363 init1: 1825 opt: 2367 Z-score: 2101.3 bits: 402.4 E(): 1.6e-109
banded Smith-Waterman score: 2367; 99.8% identity (99.8% similar) in 478 nt overlap (1- 478:4284-4760) 10 20 30 Sequen TCTTCCAGATAGCCCTGGACAAACCATGCC :::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM AATGGTAAGTGGCATTATAAGCCCCAGTGATCTTCCAGATAGCCCTGGACAAACCATGCC 4260 4270 4280 4290 4300 4310 40 50 60 70 80 90 Sequen ACCAAGCAGAAGTAAAACACCTCCACCACCTCCTCAAACAGCTCAAACCAAGCGAGAAGT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM ACCAAGCAGAAGTAAAACACCTCCACCACCTCCTCAAACAGCTCAAACCAAGCGAGAAGT 4320 4330 4340 4350 4360 4370 100 110 120 130 140 150 Sequen ACCTAAAAATAAAGCACCTACTAGCTGAAAAGAGAGAGAGTGGACCTAAGCAAGCTGCAG :::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM ACCTAAAAATAAAGCACCTACT-GCTGAAAAGAGAGAGAGTGGACCTAAGCAAGCTGCAG 4380 4390 4400 4410 4420 4430 160 170 180 190 200 210 Sequen TAAATGCTGCAGTTCAGAGGGTCCAGGTTCTTCCAGATGCTGATACTTTATTACATTTTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM TAAATGCTGCAGTTCAGAGGGTCCAGGTTCTTCCAGATGCTGATACTTTATTACATTTTG 4440 4450 4460 4470 4480 4490 220 230 240 250 260 270 Sequen CCACGGAAAGTACTCCAGATGGATTTTCTTGTTCATCCAGCCTGAGTGCTCTGAGCCTCG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM CCACGGAAAGTACTCCAGATGGATTTTCTTGTTCATCCAGCCTGAGTGCTCTGAGCCTCG 4500 4510 4520 4530 4540 4550 280 290 300 310 320 330 Sequen ATGAGCCATTTATACAGAAAGATGTGGAATTAAGAATAATGCCTCCAGTTCAGGAAAATG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM ATGAGCCATTTATACAGAAAGATGTGGAATTAAGAATAATGCCTCCAGTTCAGGAAAATG 4560 4570 4580 4590 4600 4610 340 350 360 370 380 390 Sequen ACAATGGGAATGAAACAGAATCAGAGCAGCCTAAAGAATCAAATGAAAACCAAGAGAAAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM ACAATGGGAATGAAACAGAATCAGAGCAGCCTAAAGAATCAAATGAAAACCAAGAGAAAG 4620 4630 4640 4650 4660 4670 400 410 420 430 440 450 Sequen AGGCAGAAAAAACTATTGATTCTGAAAAGGACCTATTAGATGATTCAGATGATGATGATA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM AGGCAGAAAAAACTATTGATTCTGAAAAGGACCTATTAGATGATTCAGATGATGATGATA 4680 4690 4700 4710 4720 4730 460 470 Sequen TTGAAATACTAGAAGAATGTATTATTTC :::::::::::::::::::::::::::: EM_HUM TTGAAATACTAGAAGAATGTATTATTTC 4740 4750 4760 A ins
Nhận xét:
Đột biến thêm 1 nucleotid c.4463Ains gây đột biến dịch khung đọc trên chuỗi polypeptid và làm xuất hiện mã kết thúc (X) ở vị trí 1461(p.Glu1461X) gặp ở bệnh nhân (II.2) và con bệnh nhân (III.1) đều mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình.
4. Kết quả phân tích gen APC ở gia đình số 10
Cây phả hệ gia đình số 10 2 I II III 1 1 1 2 2 I II III 1 1 1 2 2 I II III 1 1 1 2
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3B
II.2 III.1 III.3 Chứng M
Hình 3.8. Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 3B ở exon 15 của gen APC M: thang DNA chuẩn 100 bp
Nam bình thƣờng Nam bị bệnh Nam bị bệnh ung thƣ đại
trực tràng đã tử vong
Nữ bình thƣờng Nữ bị bệnh
là bệnh nhân và thành viên gia đình đƣợc tiến hành nghiên cứu
Nhận xét: Cặp mồi 3B bao phủ từ codon 1287-1467 của gen APC với kích thƣớc 536 bp. Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR là chỉ có một băng sáng, rõ nét và kích thƣớc khoảng 500 bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc của đoạn gen theo lý thuyết.
Kết quả giải trình tự AT del AT del Mẫu chứng Bệnh nhân II.2 Con BN III.1 Con BN III.2 AT del AT del Mẫu chứng Bệnh nhân II.2 Con BN III.1 Con BN III.2
Hình 3.9. Hình ảnh giải trình tự đột biến mất 2 nucleotid c.4144-4145ATdel