Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose

Một phần của tài liệu Nghiên cứu đột biến của gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình (Trang 77 - 79)

a. Nguyên tắc

DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trƣờng chúng sẽ di chuyển về phía cực dƣơng của điện trƣờng. Do hiệu ứng EEO khi điện di trên nền agarose trong dung dịch đệm, khả năng di chuyển của DNA phụ thuộc vào nồng độ gel agarose, hiệu điện thế, đệm sử dụng, kích thƣớc DNA, dạng tồn tại DNA. DNA plasmid dạng siêu xoắn di chuyển nhanh hơn dạng thẳng. DNA kích thƣớc lớn di chuyển chậm hơn DNA kích thƣớc nhỏ.

Trong một phạm vi nhất định nồng độ gel agarose, kích thƣớc phân tử tỉ lệ tuyến tính với quãng đƣờng di chuyển của DNA trên gel agarose.Thƣờng thì các đoạn gene có kích thƣớc từ 300-10.000 nucleotid có thể đƣợc phân tách trên gel agarose 0,8 %.

35 CK

b. Tiến hành

* Cách chuẩn bị gel agarose 1,5%

Cân 1,5 g agarose, hoà tan trong 10mL boric acid EDTA (TBE). Sử dụng lò vi sóng để agarose tan, sau khi agarose tan hết để nguội 55-60oC, đổ vào khuôn gel, tuỳ thuộc vào số lƣợng giếng cần điện di mà cài lƣợc làm giếng 4-8-12 răng. Để bản gel đông lại và ổn định hoàn toàn.

Gỡ lƣợc, đặt bản gel vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel.

Pha dung dịch TBE 10X (Tris; acid boric; EDTA) Tris 0,89 M; acid boric 0,89 M; EDTA 2,02 M

* Tiến hành kỹ thuật điện di

Thành phần Ống chuẩn Ống bệnh nhân

Dung dịch TLPT chuẩn (Hae III) 5 µL

Sản phẩm DNA - 4 µL

Loading buffer 10X - 1 µL

Tổng số 5 µL 5 µL

- Đƣa gel agarose vào máy điện di, cho TBE ngập gel.

- Dùng pipet và đầu côn nhỏ hút lần lƣợt dung dịch ở mỗi ống đƣa vào giếng (5 µL/giếng).

- Sử dụng máy điện di 80-100V (Mupid- Nhật), điện di ở hiệu điện thế 100V khoảng 30 phút.

- Sau điện di, gel đƣợc ngâm vào ethidium bromide 20 phút, rửa qua nƣớc cất và đƣa vào soi dƣới đèn UV, chụp ảnh dƣới ánh sáng tử ngoại có bƣớc sóng λ 360nm.

Một phần của tài liệu Nghiên cứu đột biến của gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình (Trang 77 - 79)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(163 trang)