2.2.1. Dụng cụ
- Ống lấy máu chống đông EDTA - Pipet, đầu côn các loại
- Eppendorf 1,5 ml, ống phacol - Đĩa petri nuôi cấy khuẩn lạc
- Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA) - Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO) - Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA) - Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức) - Lò vi sóng (Samsung)
- Tủ nuôi cấy có chế độ lắc
- Máy đọc trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ)
- Tủ ấm
2.2.2. Hoá chất
* Hóa chất dùng để tách chiết DNA: - Dung dịch Lysis buffer
- Dung dịch K
- Proteinase K (10mg/mL)
- Dung dịch phenol: chloroform : isoamyl với tỷ lệ 25 : 24 : 1 - Dung dịch chloroform : isoamyl với tỷ lệ 24 : 1
- Ethanol 100% và ethanol 70% - Sodium acetate 3M, pH=5,2
- Dung dịch hòa tan DNA để bảo quản DNA sau khi tách
Dung dịch Lysis buffer
Hoá chất Nồng độ Lƣợng hút (tổng 500 mL) Sucrose 0,3 M 51,3 Tribase HCL (pH=7,5) 0,01 M 0,785 MgCl2 0,005 M 0,2375 Trixton X-100 1% (v/v) 5 mL Chỉnh pH=7,5 bằng HCl, dẫn nƣớc đến 500 mL Dung dịch K Hoá chất Nồng độ Lƣợng hút (tổng 200 mL) NaCl 0,075 M 0,8775 g EDTA 0,024 M 1,7868 g Chỉnh pH=8,0 bằng NaOH, dẫn nƣớc đến 200 mL
* Hoá chất để thực hiện kỹ thuật PCR (Invitrogen)
+ 10x buffer + dNTP 10 mM + Taq polymerase
* Hoá chất để điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
+ Agarose
+ Dung dịch TBE 10X (Tris; acid boric; EDTA) + Loading buffer 10X
+ Ethidium bromide
* Hoá chất để tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose (QIAGEN)
+ Dung dịch QC + Dụng dịch Sodium acetat + Dung dịch Isopropanol + Dung dịch QG + Cột QIA * Hoá chất để đọc trình tự gen + Big dye + Cột lọc + SAM solution + Terminator Solution
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu:
Nghiên cứu mô tả bệnh chứng
2.3.1. Quy trình lấy mẫu
Bệnh nhân và các thành viên gia đình của bệnh nhân, các mẫu đối chứng đƣợc lấy 5 mL máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA với hàm lƣợng 1,5 mg/mL. Quy trình đảm bảo tuyệt đối vô trùng.
2.3.2. Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi
- Cho 0,5 mL máu tƣơi toàn phần đã chống đông vào ống Eppendof 1,5 mL sau đó cho thêm vào 0,5 mL dung dịch Lysis buffer rồi để trên đá trong 10 phút.
- Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC, bỏ dịch nổi và thu cặn. lặp lại quá trình này 4 lần.
- Cho 0,5 mL dung dịch K vào, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 oC, bỏ dịch nổi và thu cặn.
- Cho 0,5 mL Lysis buffer, 12,5 µL SDS 10%, 10 µL Proteinase K, ủ ở 56 oC từ 2-3 h.
- Cho 0,5 mL phenol: chloroform: isoamyl, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o
C, hồn hợp đƣợc chia làm 3 phần: Lớp dung dịch phía trên có chứa DNA Lớp ở giữa là cặn tế bào
Lớp dƣới cùng là dịch chiết
Hút lấy phần dịch chứa DNA phía trên cùng và tiến hành lặp lại các bƣớc trên một lần nữa sẽ đảm bảo không còn tạp chất trong mẫu.
- Cho 0,5 mL chloroform: isoamyl, ly tâm mẫu ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o
C. Hút lấy phần dịch trên cùng và tiến hành lặp lại một lần nữa. - Tủa DNA bằng 1 mL cồn tuyệt đối, cho thêm 50 µL sodium acetat, để lạnh qua đêm ở -20 o
C.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC, đổ dịch nổi phía trên, thu tủa.
- Rửa tủa bằng cồn 70 oC. Tủa DNA đƣợc hoà tan bằng 50 mL nƣớc tinh khiết hoặc TE.
Phân tử DNA thu đƣợc sẽ đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng phuơng pháp đo mật độ quang ở bƣớc sóng 260/280 nm và điện di trên gel agarose 0,8%.
2.3.3. Phƣơng pháp quang phổ
* Nguyên lý của đo mật độ quang:
- Acid nucleic có phổ hấp phụ cực đại ở ánh sáng tử ngoại 260 nm là do có mặt của base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang đo ở bƣớc sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic có trong mẫu nghiên cứu.
- Protein hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 280nm do có sự hấp phụ của các acid amin thơm và dị vòng: tyrosin, tryptophan, một phần nhờ phenylalanin.
- Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm để kiểm tra độ tinh khiết của DNA. Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 thì DNA đƣợc coi là tinh sạch.
* Tiến hành đo mật độ quang
Pha 2µL DNA đã tách với 98 µL nƣớc cất với độ pha loãng 50 lần. Đọc đối chiếu với ống trắng.
- Kết quả điện di trên gel agarose 1,5%.
2.3.4. Điện di DNA sau tách chiết * Mục đích và nguyên lý: * Mục đích và nguyên lý:
Mục đích của phƣơng pháp điện di DNA là kiểm tra chất lƣợng và ƣớc lƣợng nồng độ DNA tách chiết đƣợc.
Nguyên lý của phƣơng pháp điện di DNA là: ở pH =8, acid nucleic mang điện tích âm, dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, acid nucleic sẽ di
chuyển về cực dƣơng. Các đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau. Tùy vào mục đích mà chúng ta có thể sử dụng các chất giá khác nhau để điện di acid nucleic nhƣng phổ biến nhất là sử dụng gel agarose. Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng nồng độ gel là 0,8%. Bản gel điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide sẽ phát sáng.
Chất lƣợng của DNA tốt khi vạch điện di rõ nét, băng gọn. Ngƣợc lại, phân tử DNA bị đứt gãy, lẫn nhiều protein hoặc các tạp chất khác thì hình ảnh điện di là một vệt trải dài không tạo thành băng gọn.
* Tiến hành:
- Thể tích điện di: 5 µL/giếng.
- Điện di với hiệu điện thế 110V, cƣờng độ dòng điện là 0,5 V, thời gian điện di 20 phút.
2.3.5. Kỹ thuật PCR để khuếch đại exon 15 của gen
Exon 15 của gen APC có kích thƣớc 8.535 bp. Exon 15 bao phủ từ codon 653-2843. Để khuếch đại đƣợc toàn bộ vùng gen của exon 15, 21 cặp mồi khác nhau đƣợc thiết kế, trình tự của các cặp mồi này đã đƣợc mô tả ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự của các cặp mồi để khuếch đại đoạn gen của exon 15
Đoạn Trình tự mồi xuôi, mồi ngƣợc Đoạn nucleotid đƣợc khuyếch đại (codon)
Kích thƣớc (bp) 1A 5’-AGAGTGGCACCCAACCATAG-3’ 5’- TCCCATAATGCTTCCTGGTC-3’ 649-824 526 1B 5’-CAGGCAAATCCTAAGAGAGAACA -3’ 5’- CTTGATGAAGAGGAGCTGGG-3’ 662-875 558 1C 5’- GCTCAAGCTTGCCATCTCTT- 3’ 5’- TATGGGCAGCAGAGCTTCTT-3’ 780-925 552 2A 5’- CCAGGAACTTCTTCAAAGCG- 3’ 5’-GTGAAGGACTTTGCCTTCCA-3’ 865-1038 521 2B 5’-GTCAATACCCAGCCGACCTA-3’ 5’-AGGCTGATCCACATGACGTT-3’ 998-1173 526 2C 5’-TTCCAACCACATTTTGGACA-3’ 5’-GAGCTGATTCTGCCTCTTGG-3’ 1083-1251 566 3A 5’- AACGTCATGTGGATCAGCCT-3’ 5’-TGCTGGATTTGGTTCTAGGG-3’ 1169-1335 498 3B 5’-CAGACGACACAGGAAGCAGA-3’ 5’-GCAGCTTGCTTAGGTCCACT-3’ 1287-1467 562 3C 5’- GTGAACCATGCAGTGGAATG-3’ 5’- TGTTGGCATGGCAGAAATAA-3’ 1420-1598 536 4A 5’- TTTGCCACGGAAAGTACTCC-3’ 5’-TATCATCCCCCGGTGTAAAA-3’ 1468-1615 442 4B 5’-CTGTGGCAAGGAAACCAAGT-3’ 5’-TGATTTTTGTTGGGTGCAGA-3’ 1584-1744 481 4C 5’-CCCAAAGGGAAAAGTCACAA-3’ 5’- GCTGATTGTTGGTTGGAGGT-3’ 1717-1891 524 5A 5’- TCACCTCATCATTACACGCC-3’ 5’- GGTTCTCCCTGTGAGTCAGG-3’ 1840-1997 473 5B 5’- ACTCCGGTTTGCTTTTCTCA-3’ 5’-AGCAGCAGCAGCTTGATGTA-3’ 1923-2086 489 5C 5’- GCCTTCAAGACTCAAGGGTG-3’ 2012-2190 533
5’-TTGTCCTGCCTCGAGAGATT-3’ 6A 5’- GCTGCTGCTGCATGTTTATC-3’ 5’- TGGCAACAAGGGCTTAATTCT-3’ 2097-2439 505 6B 5’- AATCTCTCGAGGCAGGACAA-3’ 5’- TCCTTTGGAGGCAGACTCAC-3’ 2281-2458 532 6C 5’- CAGGTTTATCCAAGAATGCCA-3’ 5’- TTCAGAATGAGACCGTGCAA-3’ 2359-2482 458 7A 5’- CCCACCTAATCTCAGTCCCA-3’ 5’- CAATCACCGGGGGAGTATTA-3’ 2442-2619 530 7B 5’- AAATGGCACCTGCTGTTTCT-3 5’- TTCCACTGGATTCTGTGCTG-3’’ 2526-2708 546 7C 5’- TTGGAAAATCGCCTGAACTC-3’ 5’- TGGCTTCCAGAACAAAAACC-3’ 2667-2843 524
* Quy trình của kỹ thuật PCR
+ Thành phần của phản ứng: Thành phần Thể tích (µL) 10X buffer 0,5 10 mM dNTP 0,5 MgCl2 50 mM 0,75 Taq polymerase 0,2
5 pmol mồi xuôi 1
5 pmol mồi ngƣợc 1
DNA 1,5
Nƣớc cất 19,55
+ Chu trình nhiệt của phản ứng: 94oC/5 phút → 94o C/30 giây 58oC/20 giây 72oC/20 giây→ 72o C/5 phút→ 4o C/∞ Sản phẩm sau PCR đƣợc điện di 5 µL trên gel agarose 1,5 % (nhuộm bởi ethidium) để kiểm tra. Kết quả của mẫu bệnh nhân đƣợc so sánh với mẫu đối chứng và marker chuẩn.
2.3.6. Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose
a. Nguyên tắc
DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trƣờng chúng sẽ di chuyển về phía cực dƣơng của điện trƣờng. Do hiệu ứng EEO khi điện di trên nền agarose trong dung dịch đệm, khả năng di chuyển của DNA phụ thuộc vào nồng độ gel agarose, hiệu điện thế, đệm sử dụng, kích thƣớc DNA, dạng tồn tại DNA. DNA plasmid dạng siêu xoắn di chuyển nhanh hơn dạng thẳng. DNA kích thƣớc lớn di chuyển chậm hơn DNA kích thƣớc nhỏ.
Trong một phạm vi nhất định nồng độ gel agarose, kích thƣớc phân tử tỉ lệ tuyến tính với quãng đƣờng di chuyển của DNA trên gel agarose.Thƣờng thì các đoạn gene có kích thƣớc từ 300-10.000 nucleotid có thể đƣợc phân tách trên gel agarose 0,8 %.
35 CK
b. Tiến hành
* Cách chuẩn bị gel agarose 1,5%
Cân 1,5 g agarose, hoà tan trong 10mL boric acid EDTA (TBE). Sử dụng lò vi sóng để agarose tan, sau khi agarose tan hết để nguội 55-60oC, đổ vào khuôn gel, tuỳ thuộc vào số lƣợng giếng cần điện di mà cài lƣợc làm giếng 4-8-12 răng. Để bản gel đông lại và ổn định hoàn toàn.
Gỡ lƣợc, đặt bản gel vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel.
Pha dung dịch TBE 10X (Tris; acid boric; EDTA) Tris 0,89 M; acid boric 0,89 M; EDTA 2,02 M
* Tiến hành kỹ thuật điện di
Thành phần Ống chuẩn Ống bệnh nhân
Dung dịch TLPT chuẩn (Hae III) 5 µL
Sản phẩm DNA - 4 µL
Loading buffer 10X - 1 µL
Tổng số 5 µL 5 µL
- Đƣa gel agarose vào máy điện di, cho TBE ngập gel.
- Dùng pipet và đầu côn nhỏ hút lần lƣợt dung dịch ở mỗi ống đƣa vào giếng (5 µL/giếng).
- Sử dụng máy điện di 80-100V (Mupid- Nhật), điện di ở hiệu điện thế 100V khoảng 30 phút.
- Sau điện di, gel đƣợc ngâm vào ethidium bromide 20 phút, rửa qua nƣớc cất và đƣa vào soi dƣới đèn UV, chụp ảnh dƣới ánh sáng tử ngoại có bƣớc sóng λ 360nm.
2.3.7. Tinh sạch đoạn DNA từ gel agarose
a. Nguyên tắc
Trong công trình này chúng tôi sử dụng kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAGEN. Nguyên tắc là dựa vào khả năng bám của DNA lên màng silica trong ống tinh sạch khi có mặt nồng độ cao các muối chatropic ở pH <7,5. Đệm QG giúp hoà tan gel và tạo điều kiện các thành phần này. DNA sau đó sẽ đƣợc thôi ra khỏi màng bằng đệm thôi EB thuận lợi để DNA bám lên màng. Sự bám DNA lên màng có tính đặc hiệu nên những thành phần khác không đƣợc giữ lại, đệm rửa PE sẽ loại hoàn toàn.
b. Tiến hành
Bƣớc 1: Cắt phần gel agarose có DNA nghiên cứu
- Sau khi soi dƣới tia UV λ 360 nm bản gel đã nhuộm bằng Ethidium Bromide, cắt lấy băng của mẫu DNA nghiên cứu. Đặt miếng gel vào ống đã xác định trƣớc khối lƣợng. Xác định khối lƣợng miếng gel đã cắt. Bƣớc 2: Gắn DNA lên màng silica
- Bổ sung đệm QG theo tỉ lệ thể tích 300 μl/100 mg gel.
- Ủ hỗn hợp phản ứng ở 50°C trong 10 phút tới khi mảnh gel tan hoàn toàn, trong quá trình ủ đảo nhẹ ống 2-3 lần.
- Kiểm tra đảm bảo dung dịch sau khi ủ có màu vàng (chứng tỏ pH < 7,5 pH phù hợp để gắn DNA lên màng). Nếu dung dịch có màu cam hay tím, thêm 10 μl sodium acetate pH= 5 để dung dịch chuyển sang vàng. - Bổ sung isopropanol tỉ lệ 100 μl isopropanol/100 mg gel.
- Chuyển dung dịch sang cột đã đặt sẵn trong ống 2 mL sạch , ly tâm 1 phút. Loại dịch ly tâm.
- Bổ sung 0,5 mL đệm QG vào cột, ly tâm 1 phút. Bƣớc 3: Loại bỏ các thành phần không gắn lên màng sillica
- Thêm 0,75 mL đệm rửa PE vào cột, ly tâm 1 phút.
- Loại dịch ly tâm, ly tâm tiếp trong 1 phút. Chuyển cột vào Eppendorf 1,5 mL sạch.
Bƣớc 4: “Thôi” DNA ra khỏi màng sillica - Bổ sung 50 μl nƣớc khử ion, vô khuẩn. - Ly tâm 1 phút, thu dịch trong Eppendoff.
Các bƣớc ly tâm đều đƣợc thực hiện ở tốc độ 12000 vòng/phút, ủ ở nhiệt độ phòng.
- Cắt bản gel chứa DNA với kích thƣớc nhỏ nhất vào ống eppendorf. - Thêm vào 400 µL dung dịch QC, lắc đều, ủ 56oCtrong 10 phút để gel tan hoàn toàn.
- Thêm vào 10 µL 3M Sodium acetat, trộn đều.
- Thêm vào 350 µL isopropanol, lắc đều không ly tâm.
- Cho dung dịch chứa Isopropanol, DNA, Sodium acetat, QC vào giữa cột QIA quick colum, ly tâm 10.000 vòng/1 phút, đổ dịch phía dƣới cột thu tủa.
- Thêm 500 µL dung dịch QG vào giữa cột, ly tâm 10.000 vòng/1 phút, đổ dịch phía dƣới cột thu tủa.
- Thêm 750 µL dung dịch PE vào giữa cột, ly tâm 10.000 vòng/ 1 phút để loại hết buffer, chuyển cột sang ống 1,5 mL.
- Thêm 20 µL nƣớc cất vào giữa ống để 5 phút, ly tâm 10.000 vòng/ 1 phút thu DNA. 2.3.8. Giải trình tự gen 2.3.8.1. Phản ứng giải trình tự + Chu trình nhiệt: 96 oC /1 phút 94 oC /10 giây 50 oC /5 giây 25 chu kỳ 60 oC /4 phút 4 oC /∞ + Thành phần của phản ứng: Thành phần Thể tích (µL) Terminator ready 8 Mẫu PCR 2
10 pmol mồi xuôi 0,4
Nƣớc cất 9,6
Tổng số 20
2.3.8.2. Tinh sạch sản phẩm
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự:
- Thêm 45 µL SAM solution vào ống PCR.
- Bổ sung 10 µL Terminator Sol, lắc đều ở 9.000 vòng/phút trong 30 phút.
2.3.8.3. Giải trình tự gen
Theo qui trình của Matsuo và cs. Trình tự nucleotid của mẫu nghiên cứu với trình tự nucleoti của Genbank để xác định đột biến bằng phần mềm FÁTA để xác định đột biến, và so sánh với trình tự acidamin của Genbank bằng phần mềm Translate để xác định đột biến.
2.3.9. Phân tích tiền sử gia đình của các bệnh nhân
* Việc phân tích tiền sử gia đình đƣợc thực hiện ở các gia đình bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình nhằm tìm ra những thành viên có nguy cơ mắc bệnh cao vì đây là bệnh lý di truyền:
* Minh họa gia đình có tiền sử bị bệnh ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình (gia đình số 1):
3 1 1 2 4 1
Nam bình thƣờng Nam bị bệnh Nam bị bệnh ung thƣ đại
trực tràng đã tử vong
Nữ bình thƣờng Nữ bị bệnh Nữ bị bệnh ung thƣ đại
trực tràng đã tử vong
là bệnh nhân và thành viên gia đình đƣợc tiến hành nghiên cứu
I
II
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc tiến hành dựa trên sự tự nguyện tham gia của các gia đình có bệnh nhân bị ung thƣ đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình trên lâm sàng và giải phẫu bệnh. Các xét nghiệm phân tích gen chỉ thực hiện khi có sự đồng ý của bệnh nhân và ngƣời nhà bệnh nhân. Đối tƣợng nghiên cứu sẽ đƣợc nhận tiền bồi dƣỡng cho quá trình đi lại, khám và lấy máu, hoàn toàn miễm phí các xét nghiệm phân tích gen.
Các thông tin về bệnh nhân và ngƣời nhà bệnh nhân, kết quả chẩn đoán đƣợc hoàn toàn giữ bí mật. Nghiên cứu đƣợc tiến hành hoàn toàn vì mục đích khoa học, không vì bất kỳ mục đích nào khác.