1.4.1.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase. Với nguyên liệu là bốn loại nucleotid, enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Kỹ thuật đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngƣợc có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn. Kỹ thuật PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục đƣợc dùng để làm khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của kỹ thuật PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm đƣợc xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [82].
Số lƣợng chu kỳ trong PCR thƣờng không vƣợt quá 40. Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi số chuỗi DNA. Nhƣ vậy, sau n chu kỳ số lƣợng sợi DNA là 2n. Nhờ vậy, đủ số lƣợng DNA để có thể tách ra khi điện di và có thể phát hiện đƣợc sau khi nhuộm và để có thể tách dòng hoặc giải trình tự.
1.4.1.2. Các kỹ thuật PCR thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh ung thư đại trực tràng đa polyp tuyến gia đình
* PCR đơn mồi (monoplex PCR): PCR đơn mồi là PCR kinh điển nhất, trong mỗi kỹ thuật PCR, chỉ sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA của tế bào.
Ứng dụng trong ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình
Các tác giả đã sử dụng từng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại từng exon của gen APC bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR sẽ đƣợc giải trình tự. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR đơn mồi để khuếch đại từng đoạn gen của exon 15 gen APC. Mẫu bệnh nhân đƣợc tiến hành song song với mẫu đối chứng, nếu mẫu đối chứng và mẫu bệnh nhân xuất hiện vạch DNA tƣơng ứng với kích thƣớc của exon đƣợc khuếch đại, sản phẩm PCR thu đƣợc là sản phẩm đặc hiệu. Vạch điện di của sản phẩm PCR đƣợc cắt ra từ gel agarose và đƣợc tinh sạch bằng Kit QIAGEN, sau đó đƣợc tiến hành giải trình tự trực tiếp.
Hình 1.7. Kết quả sản phẩm PCR của đoạn gen 2B của exon 15 gen APC sau điện di trên gel agarose 1%
C: Mẫu đối chứng, 1-6 mẫu của BN KĐT thể FAP, M: thang DNA chuẩn 100 bp
Hình ảnh điện di cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc rõ nét và chỉ có một vạch duy nhất với kích thƣớc đặc hiệu khoảng hơn 500 bp.
* PCR đa mồi (multiplex PCR)
Là kỹ thuật PCR sử dụng đồng thời cùng một lúc nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau để nhân các đoạn DNA đặc trƣng khác nhau trên một phân tử DNA, hoặc trên các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật PCR đa mồi thƣờng sử dụng để nhân đồng thời các exon trên một gen nào đó của sinh vật bậc cao. Điều quan trọng nhất là phải thiết kế các cặp mồi có cùng nhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, đồng thời các mồi này không bắt cặp với nhau và độ nhạy phát hiện không giảm mà vẫn tƣơng đƣơng nhƣ độ nhạy của PCR đơn mồi.
Ứng dụng trong ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình
Gen APC gồm 15 exon. Để phát hiện đột biến mất đoạn gen, nhiều tác giả thƣờng sử dụng phƣơng pháp PCR đa mồi nhƣ nghiên cứu của Ester Castellasague (2008) đã sử dụng 18 cặp mồi kích thƣớc 130-330 nucleotid bao phủ toàn bộ vùng mã hóa của gen APC bằng 3 phản ứng multiplex. Multiplex 1 khuếch đại các exon 1, 3, 8, 10, 11, 15 I. Multiplex 2 khuếch đại các exon 2, 5, 6, 9, 15 III. Multiplex 3 khuếch đại các exon 4, 7, 15 II, 15 IV [39].
* Kỹ thuật PCR phiên mã ngược (Reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)
mRNA đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase). Mồi đƣợc sử dụng có thể là oligonucleotide T (oligo-dT) để bắt
cặp với đuôi polyA của các mRNA, cũng có thể là các hexanucleotide (gồm 6 nucleotide có trình tự ngẫu nhiên) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên phân tử RNA. Sau đó cDNA đƣợc khuếch đại bằng PCR nhờ enzym Taq
polymerase [104].
Ứng dụng của kỹ thuật RT-PCR trong ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình
Gen APC dài 14000 nucleotid, có cấu trúc gồm 15 exon, gen mã hóa ra phân tử mRNA dài 8,5 kb. Ở cấu trúc DNA, các exon nằm xen kẽ với các intron có kích thƣớc lớn. Do vậy, để khuếch đại 15 exon mang chức năng mã hóa protein từ DNA, ngƣời ta phải thiết kế 37 cặp mồi. Nhƣng nhờ phản ứng RT-PCR, phân tử mRNA đƣợc chuyển thành cDNA. Trên phân tử cDNA, 15 exon nằm liên tục với nhau, không bị xen kẽ bởi các intron. A-L Moisio (2002) đã thiết kế 2 cặp mồi và sử dụng 2 phản ứng PCR để khuếch đại đƣợc toàn bộ chiều dài exon 1-14 của gen APC. Đoạn 1A (exons 1–9) đƣợc sử dụng với các cặp mồi 1AF 5′ -CTG CAG CTT CAT ATG ATC -3′ và 1AR 5′-AGA GTC TTT GTC ATT GCA T -3′, và đoạn 1B (exons 8–14) 1BF với các cặp mồi 5′-GCA ACT TCT GGT AAT GGT C-3′ và 1BR 5′-CAT AAT CAC CAT AGA GAC T-3′ [22]. Jian-Qiu sheng (2010) đã sử dụng 5 cặp mồi cho phản ứng PCR lần 2 để khuếch đại 5 đoạn DNA chứa toàn bộ exon 15, mỗi đoạn có kích thƣớc khoảng 1000-1400 nucleotid [71]. Sau khi khuếch đại, các sản phẩm PCR có thể điện di trên agarose để xác định đột biến mất đoạn gen. Mặt khác, 5 đoạn gen này có thể đƣợc tinh sạch và giải trình tự để phát hiện các dạng đột biến khó xác định của gen APC nhƣ đột biến điểm.