CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.2. Thẩm định quy trình định lượng carvedilol trong viên nén nghiên cứu bằng
bằng phương pháp đo HPLC [6]
Tính đặc hiệu
Chuẩn bị các dung dịch:
- Dung dịch đệm: Hòa tan 0,7 g kali dihydrophosphat khan trong 500 ml nước, thêm 10
ml triethylamin. Điều chỉnh bằng acid phosphoric tới pH 3,0 ± 0,1.
- Pha động: Hòa tan 1,04 g natri dodecyl sulfat với 150 ml dung dịch đệm trong bình
định mức 2 lít, siêu âm. Thêm 720 ml acetonitril, pha loãng đến vạch bằng nước. Lọc qua màng lọc nylon 66 có kích thước lỗ lọc 0,2 µm.
- Dung mơi pha lỗng: Methanol - dung dịch acid hydroclorid 1M (9:1)
- Dung dịch methanol: Methanol và nước (1:1)
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg carvedilol chuẩn vào bình định
mức 100 ml, thêm 70 ml hỗn hợp dung mơi pha lỗng và nước (9:1), siêu âm đến khi dung dịch trong suốt. Định mức đến vạch với cùng dung môi, lắc đều
- Dung dịch chuẩn: Hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức
100 ml, thêm dung dịch methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm (Dung dịch thử gốc: Cân xác định khối lượng trung bình của 20 viên, nghiền
thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương đương 25 mg carvedilol, cho vào bình định mức 100 ml. Thêm 10 ml nước, lắc bằng tay, sau đó thêm 70 ml dung mơi pha lỗng, siêu âm trong 30 phút. Lắc bằng máy lắc trong khoảng 30 phút, thêm dung mơi pha lỗng đến vạch, lắc đều. Lấy khoảng 50 ml dung dịch này ly tâm ở tốc độ 2000 v/p trong 10 phút
- Dung dịch thử: Hút chính xác 5,0 ml dung dịch thử gốc cho vào bình định mức 100
ml, thêm dung dịch methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, bỏ 5 ml dịch lọc đầu.
- Dung dịch placebo: Cân chính xác khoảng một lượng bột placebo tương ứng, xử lý
tương tự dung dịch thử.
- Mẫu trắng: Dung dịch methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
- Tiến hành: Tiêm lần lượt các dung dịch mẫu trắng, dung dịch placebo, dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống sắc ký và ghi nhận sắc ký đồ
+ Trên sắc ký đồ của dung dịch thử: Độ phân giải của các pic tương ứng với carvedilol và tá dược (nếu có) ít nhất là 1,5.
+ Pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử có thời gian lưu tương ứng với pic chính tương ứng trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn.
+ Sắc ký đồ dung dịch placebo khơng có pic có thời gian lưu tương ứng với pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.
Tính tương thích hệ thống
- Thực hiện tiêm lặp lại 6 lần cùng dung dịch chuẩn phầnTính đặc hiệu ở mục 2.2.1.2, các thông số sắc ký của 6 lần tiêm phải đạt yêu cầu
- Yêu cầu: RSD ≤ 1,0%
Tính tuyến tính
Chuẩn bị các dung dịch:
- Dung dịch chuẩn gốc: Dùng dung dịch chuẩn gốc phần Tính đặc hiệu ở mục 2.2.1.2
- Hút chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc cho lần lượt vào các bình định mức 100 ml đã đánh số sẵn theo bảng sau, thêm dung dịch methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm
Tiến hành:
- Tiêm lần lượt các dung dịch trên vào hệ thống sắc ký từ nồng độ thấp đến nồng độ cao
- Dựa vào nồng độ và tỉ lệ diện tích pic thu được, dùng bảng tính Excel để vẽ đường đồ thị biểu thị sự tương quan giữa nồng độ dung dịch và tỉ lệ diện tích pic, xác định phương trình hồi quy và hệ số tương quan tuyến tính. Xác định Y - intercept (%) = b (intercept)/ đáp ứng ở nồng độ 100% * 100.
- Yêu cầu: R ≥ 0,999, Y – intercept (%) ≤ 2,0%
Độ chính xác
● Độ lặp lại
- Chuẩn bị mẫu:
Dung dịch chuẩn: Dùng dung dịch chuẩn phần Tính đặc hiệu ở mục 2.2.1.2
Dung dịch thử: Chuẩn bị 6 dung dịch thử như trong phần Tính đặc hiệu ở mục 2.2.1.2
- Phân tích mẫu: Tiến hành sắc ký các dung dịch trên, ghi nhận sắc ký đồ. - Tính kết quả:
Tính hàm lượng (%) dược chất so với hàm lượng ghi trên nhãn của từng mẫu trong 6 mẫu thử trên. Từ các hàm lượng (%) thu được của 6 mẫu, tính độ lệch chuẩn tương đối với độ tin cậy P = 95% theo công thức:
Cơng thức tính độ lệch chuẩn tương đối
x100 X SD RSD% 1 n X Xi SD 2
Khoảng tin cậy của trị số trung bình ứng với P =0,95 bậc tự do n-1:
n SD x t X
Xi: Là giá trị đo được thứ i. : Là giá trị trung bình. n: Số lần đo.
t: t (5;5%) = 2,015 - Yêu cầu: RSD ≤ 2,0%
● Độ chính xác trung gian
- Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phịng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau, thiết bị khác nhau. Trong điều kiện thực tế đề tài áp dụng thay đổi kiểm nghiệm viên trong cùng một phịng thí nghiệm.
- Chuẩn bị mẫu – Phân tích mẫu:
Chuẩn bị mẫu chuẩn và 6 dung dịch mẫu thử, tiến hành phân tích tương tự phần Độ lặp
lại ở mục 2.2.1.2 ở trên, được thực hiện bởi kiểm nghiệm viên thứ 2.
- Yêu cầu: (RSD của 12 số liệu của 2 kiểm nghiệm viên) ≤ 2,0%. RSD của 12 giá trị
đo đạt u cầu: Khơng có sự khác nhau rõ rệt về giá trị trung bình của 2 lần thử nghiệm.
Độ đúng
Chuẩn bị mẫu và phân tích mẫu:
- Dung dịch chuẩn: Dùng dung dịch chuẩn trong phần Tính đặc hiệu ở mục 2.2.1.2
- Chuẩn bị mẫu thử độ đúng
- Cân chính xác lượng placebo và lượng cân chuẩn carvedilol như bảng trên cho vào các bình định mức 100 ml đã đánh số sẵn, thêm 10 ml nước, lắc bằng tay, sau đó
thêm 70 ml dung mơi pha loãng, siêu âm trong 30 phút. Lắc bằng máy trong khoảng 30 phút, thêm dung mơi pha lỗng vừa đủ đến vạch. Ly tâm một lượng thích hợp (khoảng 50 ml) ở tốc độ 2000 v/p trong 10 phút. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, bỏ 5 ml dịch lọc đầu.
- Tiến hành sắc ký các dung dịch trên, ghi nhận sắc ký đồ. - Tính kết quả và so sánh với tiêu chuẩn chấp nhận.
- Từ kết quả phân tích trên, tính ra lượng dược chất có trong từng mẫu. - Tỷ lệ phục hồi (%) = (Hàm lượng tìm thấy / Hàm lượng cho vào) * 100. - Yêu cầu: Tỉ lệ phục hồi ở mỗi nồng độ: 98,0% - 102,0%, RSD ≤ 2,0%
Khoảng xác định
- Được xác định dựa vào kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, khoảng này nằm trong đường tuyến tính, đáp ứng yêu cầu về tỷ lệ phục hồi, độ chính xác.
- Yêu cầu: Từ 70% đến 130%