CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.1. Thẩm định quy trình định lượng carvedilol trong thử nghiệm độ hòa tan
bằng phương pháp quang phổ UV-Vis [6].
Điều kiện thử:
- Thiết bị: Kiểu cánh khuấy.
- Mơi trường hịa tan: 900 ml dung dịch đệm pH 1,45 [dung dịch acid hydroclorid 0,7% (7 ml/l), chỉnh về pH 1,45 ± 0,2 bằng dung dịch sodium hydroxid 50% (kl/kl)]
- Nhiệt độ: 37 ± 0,5oC. - Tốc độ quay: 50 vòng/phút. -Thời gian khuấy: 30 phút.
Phương pháp kiểm nghiệm
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 7 mg chuẩn carvedilol, cho vào bình định mức 250 ml, thêm 5 ml methanol và siêu âm cho đến khi tan hết. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm mơi trường hịa tan vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch này cho vào bình định mức 20 ml, thêm mơi trường hịa tan vừa đủ đến vạch, lắc đều
- Dung dịch thử: Cho 1 viên hoặc 1 lượng cốm tương ứng 6.25mg Carvedilol (đối với thử nghiệm bằng cốm) vào mỗi bình thử độ hịa tan chứa mơi trường hịa tan đạt nhiệt độ thử nghiệm, vận hành thiết bị đến thời gian quy định, tắt thiết bị. Hút một phần dịch hòa tan, lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Tiến hành: Điều kiện đo UV: - Bước sóng: 285 và 380 nm - Cốc đo 1 cm
- Mẫu trắng: mơi trường hịa tan Tính kết quả:
- Tính độ hấp thụ hiệu chỉnh của dung dịch chuẩn và dung dịch thử Acorr = A285 – A380
- Trong đó:
Acorr : độ hấp thụ hiệu chỉnh của dung dịch chuẩn hoặc dung dịch thử
A285 : độ hấp thụ của dung dịch chuẩn hoặc dung dịch thử ở bước sóng 285 nm A380 : độ hấp thụ của dung dịch chuẩn ở bước sóng 380 nm
- Tính phần trăm carvedilol C24H26N2O4 hịa tan theo cơng thức sau: % Hoạt chất hịa tan = (AU/AS) × CS × (V/L) × 100
Trong đó:
AU : độ hấp thụ hiệu chỉnh của dung dịch thử AS : độ hấp thụ hiệu chỉnh của dung dịch chuẩn CS : nồng độ của dung dịch chuẩn (mg/ml) V : thể tích mơi trường hịa tan, 900 ml
L : Hàm lượng ghi nhãn của carvedilol trong 1 viên (mg)
- Yêu cầu về lượng hoạt chất hòa tan trong mỗi viên được đánh giá theo bảng sau:
Quy trình thẩm định
Tính đặc hiệu
Chuẩn bị các dung dịch
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 7 mg chuẩn carvedilol, cho vào bình
định mức 250 ml, thêm 5 ml methanol và siêu âm cho đến khi tan hết. Để nguội đến nhiệt độ phịng, thêm mơi trường hòa tan vừa đủ đến vạch, lắc đều
- Dung dịch chuẩn: Hút chính xác 5,0 ml dung dịch này cho vào bình định mức 20 ml
thêm mơi trường hịa tan vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Dung dịch thử: Cân xác định khối lượng 20 viên nén bao phim, nghiền thành bột
mịn. Cân lượng bột viên tương đương khối lượng 1 viên nén bao phim cho vào cốc thử độ hòa tan chứa mơi trường hịa tan đã đạt nhiệt độ thử nghiệm, vận hành thiết bị đến thời gian quy định. Tắt thiết bị. Hút 20 ml dịch sau khuấy hòa tan, lọc qua màng lọc 0,45 µm, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lọc qua màng lọc 0,45 µm
- Dung dịch placebo: Cân chính xác khoảng một lượng bột placebo tương ứng, xử lý
tương tự dung dịch thử.
Bước Số
viên Giới hạn chấp nhận
B1 6 Mỗi viên khơng được ít hơn Q + 5 %
B2 6 Trung bình của 12 viên (B1+B2) bằng hoặc lớn hơn Q, và khơng có viên nào ít hơn Q - 15 %
B3 12 Trung bình của 24 viên (B1+B2+B3) bằng hoặc lớn hơn Q, khơng có quá 2 viên ít hơn Q - 15 %, và khơng có viên nào ít hơn Q - 25 %
- Mẫu trắng: Mơi trường hịa tan. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
- Tiến hành: Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch placebo, dung dịch chuẩn, dung dịch thử theo điều kiện được nêu trong phần Độ hòa tan.
- Yêu cầu: Độ hấp thụ hiệu chỉnh của dung dịch placebo không quá 2,0% so với độ
hấp thụ hiệu chỉnh của dung dịch thử
Tính tương thích hệ thống
- Đo độ hấp thụ mẫu chuẩn trong phần tính đặc hiệu lặp lại 6 lần, từ kết quả thu được tính giá trị độ lệch chuẩn tương đối.
- Yêu cầu: RSD ≤ 1,0%
Tính tuyến tính
Chuẩn bị và phân tích mẫu:
- Dung dịch chuẩn gốc: Dùng dung dịch chuẩn gốc mục Độ hịa tan - tính đặc hiệu
- Hút chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc cho lần lượt vào các bình định mức đã đánh số sẵn theo bảng sau, thêm nước đến vạch, lắc đều.
Bảng 2.4. Các Khoảng nồng độ dung dịch chuẩn gốc
Khoảng nồng độ (%) Thể tích chuẩn gốc (ml) Pha lỗng (ml) Nồng độ carvedilol (mg/ ml) 40 2,0 20 0,003 80 4,0 20 0,006 100 5,0 20 0,007 120 6,0 20 0,008 140 7,0 20 0,010
- Tiến hành đo độ hấp thụ các dung dịch trên từ nồng độ thấp đến nồng độ cao
- Dựa vào nồng độ và độ hấp thụ thu được, dùng bảng tính Excel để vẽ đường đồ thị biểu thị sự tương quan giữa nồng độ dung dịch và độ hấp thụ, xác định phương trình hồi quy và hệ số tương quan tuyến tính. Xác định Y - intercept (%) = b (intercept)/ đáp ứng ở nồng độ 100% * 100.
- Yêu cầu: R ≥ 0,995, Y - intercept (%) ≤ 2,0%
Độ chính xác
+ Độ lặp lại
Chuẩn bị mẫu:
- Dung dịch thử: Chuẩn bị 6 dung dịch thử như trong phần tính đặc hiệu.
- Phân tích mẫu:
- Tiến hành đo độ hấp thụ các dung dịch trên. - Tính kết quả:
Tính hàm lượng (%) dược chất so với hàm lượng ghi trên nhãn của từng dược chất trong 6 mẫu thử trên. Từ các hàm lượng (%) thu được của 6 mẫu, tính độ lệch chuẩn tương đối với độ tin cậy P = 95% theo cơng thức:
Cơng thức tính độ lệch chuẩn tương đối
x100 X SD RSD% 1 n X Xi SD 2
Khoảng tin cậy của trị số trung bình ứng với P =0,95 bậc tự do n-1:
n SD x t X
Xi: Là giá trị đo được thứ i. : Là giá trị trung bình. n: Số lần đo.
t: t (5;5%) = 2,015 - Yêu cầu: RSD ≤ 3,0%
+ Độ chính xác trung gian
- Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phịng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau, thiết bị khác nhau. Trong điều kiện thực tế đề tài áp dụng thay đổi kiểm nghiệm viên (KNV) trong cùng một phịng thí nghiệm.
Chuẩn bị mẫu – Phân tích mẫu:
- Chuẩn bị mẫu chuẩn và 6 dung dịch mẫu thử, tiến hành phân tích tương tự phần Độ
lặp lại ở mục 2.2.1.1, được thực hiện bởi kiểm nghiệm viên thứ 2.
- Yêu cầu: (RSD của 12 số liệu của 2 KNV) ≤ 3,0%, Khơng có sự khác nhau rõ rệt về
giá trị trung bình của 2 lần thử nghiệm.
Độ đúng
Chuẩn bị mẫu và phân tích mẫu:
- Dung dịch chuẩn: Dùng dung dịch chuẩn trong phần tính đặc hiệu ở mục 2.2.1.1 X
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 50 mg chuẩn carvedilol cho vào bình
định mức 100 ml, thêm 70 ml methanol và siêu âm cho đến khi tan hết. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều
Bảng 2.5. Các khoảng nồng độ mẫu thử độ đúng
Mẫu thử độ đúng Lượng cân placebo (mg) Thể tích chuẩn gốc (ml) Pha lỗng (ml) Nồng độ carvedilol (mg/ ml) Thử 65% mẫu 1 8,5 900 0,005 Thử 65% mẫu 2 8,5 900 0,005 Thử 65% mẫu 3 8,5 900 0,005 Thử 85% mẫu 1 11,0 900 0,006 Thử 85% mẫu 2 11,0 900 0,006 Thử 85% mẫu 3 11,0 900 0,006 Thử 110% mẫu 1 14,0 900 0,008 Thử 110% mẫu 2 14,0 900 0,008 Thử 110% mẫu 3 14,0 900 0,008
- Cân chính xác lượng placebo tương ứng và hút chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc như bảng trên cho vào cốc thử độ hòa tan chứa mơi trường hịa tan đã đạt nhiệt độ thử nghiệm. Vận hành thiết bị đến thời gian quy định. Tắt thiết bị. Hút 20 ml dịch sau khuấy hòa tan, lọc qua màng lọc 0,45 µm, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
- Tiến hành đo độ hấp thụ các dung dịch trên. - Tính kết quả và so sánh với tiêu chuẩn chấp nhận.
- Từ kết quả phân tích trên, tính ra lượng dược chất có trong từng mẫu. - Tỷ lệ phục hồi (%) = (Hàm lượng tìm thấy / Hàm lượng cho vào) * 100. - Yêu cầu: Tỉ lệ phục hồi ở mỗi nồng độ: 97,0% - 103,0%, RSD ≤ 2,0%
Khoảng xác định
- Được xác định dựa vào kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, khoảng này nằm trong đường tuyến tính, đáp ứng yêu cầu về tỷ lệ phục hồi, độ chính xác.