Các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40 được tạo theo phương pháp chung đã được trình bày ở sơ đồ hình 3.6. Rễ Thổ phục linh khô 10 kg đã được nghiền nhỏ, ngâm chiết với cồn 85% nhiều lần, kiểm tra SKLM đến khi hết astilbin trong dịch mẫu. Các dịch chiết được kết hợp lại và quay cất loại dung môi thu được cao chiết TPL-EtOH. Cao chiết TPL-EtOH được chiết nhiều lần với n-hexan để loại các chất không phân cực. Phần cặn nước được chiết nhiều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lần với etyl axetat đến khi kiệt astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết etyl axetat, quay cất loại dung môi rồi tủa bằng các dung môi khác nhau thu được 144 g astilbin (TPL-As40) và các phân đoạn TPL-Đường (62 g), cặn chất trên astilbin (48g).
4.4. Hàm lƣợng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40
Các cao chiết được xác định hàm lượng astilbin dựa vào kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng astilbin trên thiết bị HPLC đã được thiết lập trong phần thực nghiệm.
4.4.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng astilbin
Về nguyên tắc phân tích, khi đã định tính được píc nào trên sắc ký đồ tương ứng với chất nào và đã có sắc ký đồ của các mẫu chuẩn với những nồng độ khác nhau thì ta có thể tính ra nồng độ của chất cần phân tích bằng phương pháp đường chuẩn, cách thức làm như sau:
-Vẽ đồ thị của diện tích píc theo nồng độ, từ đó dùng phương pháp bình phương tối thiểu để suy ra đường hồi quy.
-Từ phương trình hồi quy dạng Y = AX + B trong đó Y là diện tích píc, X là nồng độ của chất phân tích, A,B là các hệ số hồi quy, căn cứ vào sắc ký đồ của mẫu ta có được Y của chất cần phân tích, dựa vào phương trình này ta sẽ suy ra được nồng độ của chất cần phân tích trên đường chuẩn.
-Từ nồng độ này, căn cứ vào khối lượng hay thể tích của mẫu cũng như các thể tích pha loãng thì sẽ suy ra được hàm lượng của chất cần phân tích trong các mẫu.
Trên cơ sở đó, từ dung dịch astilbin gốc nồng độ 1 mg/ml tiến hành pha loãng tạo các dãy dung dịch bằng dung môi. Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 15.256; 31.25; 62.5; 250; 500µg/ml (Bảng 4.3). Tiến hành lập danh sách các mẫu chạy theo thứ tự lần lượt từ nồng độ thấp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đến cao. Chạy Sequence với bơm tự động và chương trình chạy được lập trình bằng sự hỗ trợ của phần mềm Chemstation.
Trên sắc ký đồ UV của tất cả các mẫu astilbin đều cho tín hiệu ổn định tại thời gian lưu 19.0 phút. Chúng tôi đã tiến hành dựng đường chuẩn định lượng biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ dựa trên sắc ký đồ UV.
Hình 4.11: Sắc ký đồ của hợp chất astilbin tại bƣớc sóng 291 nm trên cột Zobax eclipse XDB C18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Từ các số liệu về diện tích píc và nồng độ tiến hành xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ có phương trình hồi quy tuyến tính là Y= 17857.54213X – 71.18024, có độ tin cậy cao (R2
= 0.9998). Kết quả được trình bày trên hình 4.12 và bảng 4.3.
Bảng 4.3: Đƣờng chuẩn, r2, LOD, LOQ của các chất Astilbin
Đường chuẩn r2 LOD (μg/ml) LOQ (μg/ml) Dải nồng độ (μg/ml) Astilbin Y= 17857.54213X - 71.18024 0.9998 7.8 15.625 15.625-500
4.4.2. Đánh giá hàm lượng hợp chất astilbin trong mẫu cao chiết Thổ phục linh
Dễ dàng nhận thấy: nếu có chất chuẩn việc sàng lọc và xác nhận sự có mặt của hợp chất asilbin trong mẫu phân tích chỉ cần tiến hành việc phân tích mẫu và chất chuẩn trên cùng một điều kiện phân tích, kết quả là sự so sánh thời gian lưu của chất chuẩn với píc xuất hiện trên sắc ký đồ của mẫu phân tích.
Hình 4.13: Sắc ký đồ của mẫu TPL-As4O và astilbin trên cột Zorbax eclipe XBD C18 (4,6 x 150 mm, 5µm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu Thổ phục linh được tiến hành theo quy trình chiết ổn định khác nhau. Cân chính xác 50 mg mẫu phân tích (dạng bột). Hòa tan cặn chiết bằng MeOH, điều chỉnh thể tích chính xác 10 ml để thu được dung dịch phân tích có nồng độ 5 mg/ml. Dịch chiết trước khi bơm vào hệ thống HPLC được lọc qua màng lọc 0,45 m. Chạy phân tích các mẫu với mô hình phân tích đã xây dựng ở trên.
Thông qua các kết quả so sánh thời gian lưu, kết hợp phương trình xây dựng được từ phương trình đường chuẩn định lượng astilbin và diện tích các píc tại thời gian lưu 19,0 phút có trên các sắc ký đồ của các mẫu phân tích. Kết quả định lượng hàm lượng astilbin trong các mẫu được trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4: Kết quả định lƣợng hàm lƣợng của astilbin trong các mẫu STT Ký hiệu mẫu Hàm lƣợng astilbin cao chiết
(mg/g) %
1 TPL- As40 592 59,2
2 TPL -EtOAc 415 41,5
3 TPL- Đường 375 37,5
4 TPL-EtOH 218 21,8
Từ kết quả thu được trên bảng 4.4. Chúng ta thấy hàm lượng astilbin đã được làm giàu lên qua các bước xử lý từ 21% ở mẫu cao chiết tổng TPL- EtOH lên 41,5% mẫu cao chiết TPL-EA (Mẫu này thu được từ dịch chiết EtOAc đem cô quay loại dung môi) và đến 59,2% ở mẫu cao chiết TPL-As40. Các mẫu cao chiết trên được nghiên cứu tiếp hoạt tính sinh học về độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
4. 5. Hoạt tính độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết
Cao chiết tổng TPL-EtOH và cao TPL-As40 được xác định độc tế bào trên các dòng ung thư KB, LU-1, và MCF-7 thu được các kết quả như sau:
4.5.1. Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư KB, LU-1, MCF-7 1, MCF-7
- Trên dòng tế bào ung thư KB
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và dữ liệu. Kết quả thu được như sau:
Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ KB (µg/ml)
% Ức chế
TPL- EtOH TPL -As40 Ellipticine
100 21,90 41,89 10 µg/ml 99,50 20 4,83 16,73 2 µg/ml 79,95 4 1,04 7,66 0.4 µg/ml 28,68 0,8 -3,88 -2,91 0.08 µg/ml 17,54 IC50 > 100 > 100 0,86
Kết quả trên cho thấy hai mẫu nghiên cứu không thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu. Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là chính xác với r2 ≥ 0,99.
-Trên dòng tế bào ung thư LU-1
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và dữ liệu. Kết quả thu được như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 4.6: Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ LU-1 (µg/ml)
% Ức chế
TPL-EtOH TPL-As40 Ellipticine
100 24,82 44,38 10 µg/ml 99,67 20 3,94 18,66 2 µg/ml 71,86 4 1,32 10,66 0.4 µg/ml 28,19 0,8 -2,34 1,23 0.08 µg/ml 8,94 IC50 > 100 > 100 0,91
Kết quả trên cho thấy hai mẫu nghiên cứu không thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu. Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là chính xác với r2≥ 0,99.
- Trên dòng tế bào ung thư MCF-7
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và dữ liệu. Kết quả thu được như sau:
Bảng 4.7: Kết quả sàng lọc tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ MCF-7 (µg/ml)
% Ức chế
TPL-EtOH TPL-As40 Ellipticine
100 58,93 59,90 10 µg/ml 99,79 20 3,07 5,73 2 µg/ml 72,75 4 -1,69 -1,45 0.4µg/ml 26,92 0,8 -2,46 -3,65 0.08 µg/ml 5,74 IC50 > 100 > 100 0,93
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả trên cho thấy hai mẫu nghiên cứu không thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu. Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là chính xác với r2 ≥ 0,99.
Như vậy qua các kết quả sàng lọc độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), dòng tế bào ung thư phổi (LU-1) và dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) các mẫu cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40 đều không thế hiện hoạt tính độc tế bào ở các mức nồng độ 100 µg/ml, 20 µg/ml, 4 µg/ml, 0,8 µg/ml. Tuy chưa có nhiều công bố về sàng lọc tế bào với các dòng ung thư này trên thế giới, nhưng so với những công bố về sàng lọc tế bào đối với tế bào ung thư gan thì đây là kết quả phù hợp.
4.5.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết
Các cao chiết TPL-As40, TPL-EtOH, TPL-đường được xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp MDA, vật liệu hóa chất và phương pháp thực nghiệm đã được trình bày trong phần thực nghiệm. Các kết quả thực nghiệm hoạt tính chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan thể hiện khả năng bảo vệ tế bào gan của TPL-As40, TPL-EtOH, TPL-đường.
Tế bào gan sau khi sử dụng cho thí nghiệm chống oxi hóa với qui trình như đã trình bày ở phần phương pháp. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và của dữ liệu thu được. Dưới đây là kết quả xác định ED50 của TPL-As40, TPL-EtOH, TPL-đường.
Bảng 4.8: Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa
Nồng độ
(µg/ml) TPL-As40 TPL-EtOH TPL-Đường Curcumin
100 53,05 48,57 53,94 82,14
20 41,02 43,33 52,41 69,34
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
0.8 -3,73 -4,78 1,24 2,65
ED50 (µg/ml)
44,08 92,14 7,46 6,69
Qua quá trình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan phân lập của 3 mẫu: TPL-As40, TPL-EtOH, TPL-Đường, chúng tôi nhận thấy cả 3 mẫu thử đều có hoạt tính chống oxi hóa cao với ED50 trong khoảng từ 7,46 – 92,14 µg/ml. Trong đó TPL-Đường có hoạt tính mạnh nhất với ED50 là 7,46 µg/ml và TPL-EtOH có hoạt tính yếu nhất với ED50 là 92,14 µg/ml. Mẫu Cucurmin là chất đối chứng dương với giá trị ED50= 6,69 µg/ml.
Như vậy các mẫu nghiên cứu có hoạt tính chống oxi hóa trong thí nghiệm bảo vệ tế bào gan trước yếu tố gây oxi hóa mạnh H2O2 với ED50 trong khoảng 7,46 -92,14 µg/ml trong đó TPL-Đường có hoạt tính rất tốt
tương đương với cucurmin. Kết quả này cùng với kết quả phân lập chất 3 trong cao TPL-Đường gợi ý hoạt tính chống oxy hóa cao của TPL-Đường liên quan tới hợp chất 3 vì theo các nghiên cứu đã được công bố phân đoạn đường trong dịch chiết Thổ phục linh không có hoạt tính chống oxy hóa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
KẾT LUẬN
Các kết quả đã đạt được trong luận văn là :
1. Đã phân lập và xác định cấu trúc hoạt chất chính astilbin và 2 hoạt chất engeletin, 3-O-caffeoyl-shikimic acid từ rễ Thổ phục linh (Smilax glabra
Roxb.).
2. Đã khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ Thổ phục linh tại 8 tỉnh Miền Bắc là Thái Nguyên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Quảng Ninh, Sapa, Sơn La, Hòa Bình. Qua khảo sát đã lựa chọn vùng nguyên liệu có hàm lượng astilbin cao và có khả năng thu mua lượng lớn cho nghiên cứu là tỉnh Tuyên Quang.
3. Đã xây dựng quy trình tạo các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40, TPL- Đường từ rễ Thổ phục linh với quy mô 10 kg/mẻ cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của các cao chiết này.
4. Đã xây dựng được phương pháp xác định hàm lượng astilbin trong các mẫu thử trên thiết bị HPLC qua việc thiết lập đường chuẩn định lượng astilbin và diện tích các píc tại thời gian lưu. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng astilbin trong cao chiết tổng TPL-EtOH là 21,8%, trong TPL-As40 là 59,2% và trong TPL-Đường là 37,0%.
5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các cao chiết cho thấy các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40 không thể hiện độc tế bào với 3 dòng tế bào ung thư KB, LU-1, MCF-7 với IC50 > 100 µg/ml. Các cao chiết TPL-As40, TPL- EtOH, TPL-Đường đều có hoạt tính chống oxi hóa cao với ED50 trong khoảng từ 7,46 -92,14 µg/ml. Trong đó TPL-đường có hoạt tính mạnh nhất có ED50 7,46 µg/ml tương đương với cucurmin (ED50 = 6,69 µg/ml).
Như vậy luận văn đã hoàn thành các nội dung trong đề cương nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học của rễ Thổ phục linh. Các kết quả đạt được đã khẳng định Thổ phục linh trong nước là nguồn dược liệu quý với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hàm lượng họat chất astilbin cao (từ 1,2 -2,6% mẫu rễ Thổ phục linh khô), cùng với hoạt chất chống oxy hóa cao của các cao chiết đã mở hướng hoàn toàn có thể tạo được chế phẩm chống oxy hóa từ rễ Thổ phục linh.
KIẾN NGHỊ
Với các kết quả đã đạt được đề nghị nghiên cứu tiếp sâu hơn để tạo chế phẩm chống oxy hóa giá trị cao từ rễ thổ phục linh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Cương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn(2003), “Cây
thuốc và động vật làm thuốc ở Việt nam”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật, tập II trang 883-886.
2. Trần Văn Lộc, Trần Văn Chiến, Trần Đức Quân, Phạm Thị Ly, Trịnh Thị
Thủy, Trần Văn Sung (2007), “ Isolation of dihydrokaempferol 3-O-α-l- rhamnopyranoside and astibin from the Similax glabra roots and their transformation into auronols”, Vietnamese Academy of Science and Technology, 45(3A), 138-141.
3. Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Quyết Tiến, Trần Thị Thanh Hằng, Phạm
Hữu Điện (2010), “Nghiên cứu thành phần hóa học củ Thổ phục linh Smilax glabra Roxb. Trồng tại Thái Nguyên“, Tạp chí Khoa học, Trường ĐHSP Hà Nội Tập 55(6), tr.62-70.
4. Nguyễn Quốc Vượng, Vũ Văn Chiến, Nguyễn Thị Thu, Diệp Thị Lan Phương, Phạm Văn Cường, Châu Văn Minh (2013), “Khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ cây thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) và bán tổng hợp alphitonin bằng phương pháp đồng phân hóa taxifolin”, Tạp chí Hóa học, T 51(2AB), 208-213.
5. Nguyễn Ngọc Xuân, Đào Văn Phan, Nguyễn Duy Thuần (2000), “Bước
đầu nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của thổ phục linh (Smilax Glabra Roxb.) trên chuột nhắt”. Tạp chí Dược học, số 4, 12-16 và số 11, 18-21.
6. Cai Y, Chen T, Xu Q (2003), “Astilbin suppresses collagen-induced arthritis via the dysfunction of lymphocytes”, Inflammation Research, 52, 334-340.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
7. Cai Y, Chen T, Xu Q (2003), “Astilbin suppresses delayed-type hypersensitivity by inhibiting lymphocyte migration”, Journal of
Pharmacy and Pharmacology, 55, 691-696.
8. Chen T, Li J, Cao J, Xu Q, Komatsu K, Namba T.(1999), “A new flavanone isolated from Rhizoma Smilacis glabrae and the structural requirements of its derivatives for preventing immunological hepatocyte damage”, Planta Medica, 65, 56-59.
9. Chen T, Li, JX, Xu Q. (2000), “Phenylpropanoid glycosides from Smilax glabra”, Phytochemistry, 53, 1051-1055.
10. Cintra P, Bueno FC, Bueno OC, Malaspina O, Petacci F, Fernandes JB (2005), “Astilbin toxicity to leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera :Formicidae)”, Sociobiology, 45,347-353.
11. Closa D, Torres M, Hotter G, Bioque G, Leon OS, Gelpi E, RoselloCatafau J. (1997), “Prostanoids and free radicals in Cl4C-induced hepatotoxicity in rats: Effect of astilbin”, Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 56, 331-334.
12. Fei MJ, Wu XF, Xu Q (2005), “Astilbin inhibits contact hypersensitivity through negative cytokine regulation distinct from cyclosporin A”,
Journal of Allergy and Clinical Immunology, 116, 1350-1356.