a,Phương pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột
Chuột BALB/c khỏe mạnh được sử dụng để tách tế bào gan. Gây chết chuột bằng cồn 800, sau đó sử dụng panh, kéo mổ chuột, tách lấy gan. Gan chuột sau khi tách được rửa sạch bằng PBS, thu dịch có tế bào gan, li tâm, loại bỏ dịch nổi. Tế bào được hòa trong NH4Cl để phá vỡ hồng cầu. Sauk hi li tâm, tế bào thu được hòa lại trong môi trường MEME có 10% FBS và các thành phần cần thiết khác.
b, Phép thử sinh học kiểm tra khả năng chống oxy hóa của hoạt chất trên tế bào gan:
Tế bào gan chuột được phân lập bằng trysin 1% cho từng thí nghiệm. Sau khi được phân lập, tế bào gan sẽ được đưa vào đĩa thí nghiệm 96 giếng với mật độ 1x104
tế bào/giếng để nuôi qua đếm trong tủ ấm 5% CO2, ở 370C. Tế bào sau đó sẽ được ủ hoạt chất ở các nồng độ khác nhau trong 2h. Tiếp theo, 100µM H2O2 sẽ được đưa vào mỗi giếng và ủ trong 2h. Để xác định số tế bào gan sống sót sau tác động của H2O2 cũng như tác động của hoạt chất nghiên cứu, MTT nồng độ 1mg/ml (50 µM/giếng) sẽ được đưa vào các giếng và được ủ tiếng 4h ở 370C. Loại bỏ toàn bộ dịch nổi và đưa vào mỗi giếng 100 µM/giếng DMSO 100% và đo mật độ quang học của chất formazan tạo thành bằng máy Microplate Reader ở bước sóng 492nm. Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các số liệu được xử lí bằng phần mềm TableCurve 2D phiên bản 4.0 và exel để tính giá trị trung bình. Độ chính xác của số liệu được tính bằng R2. Nếu R2
≥ 0,95 thì kết quả được xem là đáng tin cậy với sai số thống kê P ≤ 0,05.
c, Công thức tính
% sống sót = [OD(chất thử) - OD(H2O2)] x 100 OD(Tế bào) - OD(H2O2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Giá trị ED50 (nồng độ bảo vệ được 50% đối với sự sống sót của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có ED50 < 20 µg/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc ED50 ≤ 4 µg/ml (với chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính chống oxi hóa và bảo vệ tế bào gan.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM