3.1.1.1. Qui trình phân lập astilbin và các hợp chất gần astilbin theo SKLM
Mẫu rễ Thổ phục linh khô thu mua ở Tuyên Quang (500g), được sấy khô, nghiền nhỏ và được ngâm, chiết trong ethanol 85% bằng siêu âm trong 30 phút ở 50oC. Quá trình đuợc tiến hành 5 lần (1 x 1,8 L; 4x1L) (kiểm tra SKLM thấy không còn astilbin), gộp các dịch chiết lại rồi quay cất chân không thấp loại dung môi. Phần cặn nước còn lại được chiết với n-hexan (3x 0,05 L) để loại các chất trên. Phần dịch nước được chiết 5 lần với ethyl axetat (1 x 0,05 L; 4 x 0,02 L) kiểm tra SKLM đến hết astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết EtOAc lại, quay cất loại dung môi sau đó phần cặn EtOAc được tách bằng SKC trên silicagen. Bước đầu tiên là qúa trình tách nhanh trên cột silicagen ngắn thu được các phân đoạn gồm: phân đoạn astilbin sạch (5,43 g) (chất 1); phân đoạn astilbin lẫn các chất dưới (3,07 g); phân đoạn astilbin
lẫn các chất trên (2 g); phân đoạn các chất trên 0,5g, phân đoạn các chất dưới (3 g) (Hình 3.1).
- Phân đoạn các chất trên lẫn astilbin được tách lại bằng SKC trên silicagen lặp lại nhiều lần thu được chất 2 là engeletin (dihydrokaempferol -3-
O-Rhamnopyranoside.
- Phần các chất dưới lẫn astilbin đã được tách lại bằng SKC trên silicagen thường, silicagen pha đảo, sephadex thu được hợp chất 3 là 3-O- caffeoyl-shikimic acid
Quá trình phân lập astilbin và 2 hợp chất gần astilbin (trên SKLM) được trình bày trong sơ đồ dưới đây (Hình 3.1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.1: Sơ đồ tách astilbin và các hợp chất gần trên SKLM Rễ thổ phục linh
(500 g)
Cao chiết etanol (58,4 g)
Dịch nước Dịch chiết
n-hexan
Cao chiết EtOAc
(14 g) Cao chiết n-hexan
Astilbin lẫn chất dưới 3,07 g Chất 3: 3-O-caffeoyl- shikimic acid 0,045 g Chất 1 Astilbin 5,43 g Astilbin lẫn chất trên 2 g Astilbin Tổng 6 g Hiệu suất tách 1,2%
- Ngâm chiết bằng etanol (1 x 1,8 L + 4 x 1L) - Chiết, lọc lấy dịch, cô cất loại dung môi
- Pha loãng với nước theo tỉ lệ (1: 1; V/V) - Chiết bằng n- hexan (3 x 0,05 L)
Chiết bằng EtOAc (2x 0,05 L + 3 x 0,02 L ) Quay cất loại dung môi
Tách SKC trên silicagen Hệ dung môi tách n-Hexane : EtOAc
Tách SKCtrên: - silicagen, - pha đảo - sephadex Quay cất loại dung môi Kết tinh Tách SKC Trên silicagen Chất 2: Engeletin (Dihydrokaempferol -3-O-Rha) 0,075 g Hỗn hợp chất trên 0,5 g Hỗn hợp chất dưới 3 g 0,14 g 0,43 g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.1.2. Số liệu phổ của các chất phân lập được
Chất 1: Astilbin Trạng thái: tinh thể trắng FT-IR max (cm-1): 3427, 3263, 2912, 1640, 1603, 1519, 1476, 1363, 1301, 1177, 1070, 977. ESI-MS (m/z ): 486 [M-H+2H2O]- 1 H-NMR (Me3OD; 500MHz): 6,98 (1H,d, J=1,8Hz, H-2‟), 6,86(1H, dd, J = 8,2 Hz, 1,8 Hz, H-6‟), 6,82(1H, d, J = 8,1 Hz, H-5‟), 5,94(1H, d, J= 2,1Hz, H- 6), 5,92(1H, d ,J= 2,1Hz, H-8), 5,10(1H, d, J=10,7, H-2), 4,60(1H, d, J= 10,7 Hz, H-3), 4,28(1H, dd, J= 3,6 Hz, 6,3 Hz, H-3”), 4,07(1H, d, J=1,2Hz, H-1”), 3,68(1H, d, J = 3,3 Hz & 9,6Hz, H-3”), 3,56(1H, dd, J=1,7&3,1 Hz, H-2”), 3,36(1H, d, J = 11,6 Hz, H-4”), 1,21(3H, d, J=6,2Hz, H-6”); 13 C-NMR (MeOD, 125MHz): 196,0(C-4); 168,5(C-7); 165,5(C-5); 164,1(C-9); 147,4(C-4‟); 146,5(C-3‟), 129,2(C-1‟), 120,5(C-6‟); 116,3(C-2‟), 115,5(C-5‟); 102,5(C-10); 102,1(C-1”); 97,4(C-6); 96,2(C-8); 83,9(C-2); 78,5(C-3); 73,8(C-4”); 72,2(C-3”); 71,8(C-2”); 70,5(C-5”); 17,8(C-6”). Chất 2: Engeletin (Dihydrokaempferol-3-O-L-rhamnopyranoside) FT-IR max (cm-1): 3419, 2937, 1634, 1591, 1518, 1458, 1379, 1290, 1170, 1026, 977, 826. ESI-MS (m/z ): 433 [M-H]+ 1 H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm) : 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2‟ and H-6‟), 6,86 (2H, d, J = 8,6 Hz, H-3‟ và H-5‟), 5,94 (1H, d, J = 2,1 Hz, H- 6), 5,91 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-8), 5,14 (1H, d, J = 10,9 Hz, H-2), 4.62 (1H, d, J = 10,9 Hz, H-3), 4,28 (1H, dq, J = 6,2và 9,6 Hz, H-5‟‟), 4,06 (1H, d, J = 1,2Hz, H-1‟‟), 3,68 (1H, dd, J = 3,2 và 9,6 Hz, H-3‟‟), 3,53(1H, dd, J = 1,5 and 3,0 Hz, H-2‟‟), 3,34-3,30(1H, m, H-4”) và 1,21 (3H, d, J = 6,2Hz, H-6‟‟). 13 C-NMR (MeOD, 125MHz): 196,0(C-4); 168,5(C-7); 165,4(C-5);
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 164,0(C-9); 159,3(C-4”); 130,0(C-2‟, 6‟); 128,6(C-1‟); 116,4(C-3‟, 5‟); 102,5(C-10), 102,2(C-1”); 97,4(C-6); 96,3(C-8); 83,7(C-2); 78,6(C-3); 73,7(C-5”); 72,1(C-4”); 71,7(C-2”); 70,5(C-3”); 17,83(C-6”). Chất 3: 3-O-caffeoyl-shikimic acid Trạng thái: tinh thể trắng ESI-MS (m/z ): 335[M-H]- 1 H-NMR (Me3OD; 500MHz): 7,58 (1H, d, J= 15,0Hz, H-8‟), 7,07(1H, d, J = 2 Hz, H-2‟), 6,96(1H, dd, J = 2 Hz, 8,2 Hz, H-6‟), 6,8(1H, d, J = 8,2 Hz, H-5‟), 6,59-6,56(1H, m, H-6), 6,30(1H, d, J = 15,9 Hz, H-7‟), 5,28-5,24(1H, m, H-3), 4,36(1H, t, J= 4,2 Hz, H-5), 3,84(1H, 2xd, J= 4,3 Hz, H-4), 2,97(1H, 2xd, J = 5,4 Hz, H-2a), 3,34(1H, 2xd, J= 7,3 Hz, H-2b). 13
C-NMR (MeOD, 125MHz):175,0(COOH), 169,0 (COO), 149,6(C-4‟), 147,0(C-3‟), 146,8(C-8‟), 137,1(C-6), 131,9(C-1), 127,8(C-1‟), 122,9(C-6‟), 116,5(C-5‟), 115,4(C-7‟), 115,1(C-2‟), 71,9(C-3), 71,4(C-4), 67,9(C-5), 31,7(C-2).
3.1.2. Khảo sát một số vùng nguyên liệu Thổ phục linh ở miền Bắc 3.1.2.1. Thu mua Thổ phục linh tại các vùng khảo sát 3.1.2.1. Thu mua Thổ phục linh tại các vùng khảo sát
Thổ phục linh Việt Nam được mua tại 8 tỉnh và thành phố ở miền Bắc là
Thái Nguyên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Quảng Ninh, Sapa, Sơn La, Hòa Bình. Các mẫu Thổ phục linh các vùng được trình bày trong các hình dưới đây:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu TPL Sơn La Mẫu TPL Hòa bình
Mẫu TPL Thái Nguyên Mẫu TPL Tuyên Quang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu TPL Vĩnh Phúc Mẫu TPL Sapa
Hình 3.2: Hình ảnh các mẫu Thổ phục linh ở các vùng
3.1.2.2. Quy trình chung phân lập và xác định hàm lượng astilbin từ rễ Thổ phục linh khô phục linh khô
Mẫu rễ Thổ phục linh khô (500g), được sấy khô, nghiền nhỏ và được ngâm, chiết trong ethanol 85% bằng siêu âm trong 30 phút ở 50o
C. Quá trình đuợc tiến hành 5 lần (1 x 1,8 L; 4x1 L) ( kiểm tra SKLM thấy không còn astilbin) gộp các dịch chiết lại rồi quay cất chân không thấp loại dung môi. Phần cặn nước còn lại được chiết với n-hexan (3x 0,05 L) để loại các chất trên. Phần dịch nước được chiết 5 lần với ethyl acetate ( 1 x 0,05 L + 3 x 0,02 L) kiểm tra SKLM đến hết astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết EtOAc lại, quay cất loại dung môi sau đó phần cặn EtOAc được tách bằng SKC trên silicagen thu được gồm: astilbin thô có lẫn dạng vết của chất trên và chất dưới; phần chất dưới lẫn astilbin; phân chất trên lẫn astilbin;
-Astilbin thô được kết tinh lại trong MeOH: H2O (1:1, v/v) cho astilbin khoảng 95%.
-Phần chất dưới lẫn astilbin và phần chất trên lẫn astilbin được tách tại bằng SKC trên silicagen thu được thêm astilbin có độ sạch tương đối được kết tinh lại cho astilbin có hàm lượng khoảng 95% theo HPLC.
-Hàm lượng astilbin trong rễ thổ phục linh được tính bằng tổng lượng astilbin thu được từ 3 phân đoạn tách trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3: Sơ đồ phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh khô
Rễ Thổ phục linh
(500 g)
Cao chiết etanol
Dịch nước Dịch chiết
n-hexan
Cao chiết EtOAc Cao chiết
n-hexan Astilbin lẫn chất dưới Chất Astilbin thô Astilbin lẫn chất trên Astilbin tổng
- Ngâm chiết bằng etanol (1 x 1,8 L + 4 x 1 L ) - Chiết, lọc lấy dịch, cô cất loại dung môi
- Pha loãng với nước theo tỉ lệ (1: 1; V/Vml) - Chiết bằng n- hexan (3 x 0,05 L)
Chiết bằng EtOAc (2 x 0,05 L + 3 x 0,02 L ) Quay cất loại dung môi
Tách SKC trên silicagen Hệ dung môi tách n-Hexane : EtOAc
Tách SKCtrên: - silicagen, - pha đảo - sephadex Quay cất loại dung môi Kết tinh Tách SKC Trên silicagen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.3. Giám định thu mua mẫu và xử lý mẫu Thổ phục linh 3.1.3.1. Giám định mẫu thực vật 3.1.3.1. Giám định mẫu thực vật
Sau khi đã khảo sát vùng nguyên liệu về hàm lượng astilbin ở các vùng và khả năng thu mua mẫu lượng lớn ở các vùng chúng tôi đã chọn vùng nguyên liệu cho thu mua mẫu là tỉnh Tuyên Quang. Để giám định mẫu thực vật, mẫu cây bao gồm: củ, thân cành lá đã được thu thập tại Tuyên Quang và được giám định mẫu tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, do PGS. TS. Trần Huy Thái và TS. Nguyễn Thế Cường giám định (có kèm theo văn bản “Kết quả giám định tên khoa học”).
Hình : Thổ phục linh tươi Hình : Củ Thổ phục linh tươi
Hình 3.4: Mẫu Thổ phục linh thân lá và củ tƣơi
Mẫu thực vật được giám định thuộc loài Smilaxg glabra Roxb., họ Smilacaceae.
3.1.3.2. Thu mua và xử lý mẫu
Mẫu rễ Thổ phục linh tươi (200 kg) thu mua tại Tuyên Quang được rửa sạch, để ráo nước, rồi đem thái mỏng và phơi khô trong vài ngày sau đó sấy trên tủ sấy thường ở 400
C trong 2 ngày đến khô hẳn rồi để nguội cân được 65 kg. Thổ phục linh lát mỏng khô được đóng bao trong túi polyethylene kín và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
được sấy lại trước khi nghiền thành bột. Một số hình ảnh về mẫu Thổ phục linh tươi được thu mua tại Tuyên Quang, được trình bày trong hình 3.5.
Củ tươi TPL TPL thái mỏng
Hình 3.5: Hình ảnh mẫu Thổ phục linh tƣơi tại Tuyên Quang
3.1.4. Tạo các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40
Mẫu rễ Thổ phục linh khô 10 kg được sấy khô, nghiền nhỏ và được cho vào trong thiết bị chiết thủy tinh có van khóa ở đáy, ethanol 85% (40 L) được cho vào và hỗn hợp được ngâm ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày với khuấy nhiều lần rồi tháo khóa lấy dịch chiết. Sau khi dịch chiết được tháo kiệt, ethanol 85% (30 L) được cho vào bình. Hỗn hợp được ngâm và lấy dịch chiết tương tự như vậy thêm 4 lần nữa (4 x 30 L), kiểm tra dịch chiết thấy không còn vết của astilbin thì dừng chiết. Các dịch chiết được kết hợp lại và quay cất loại dung môi trên thiết bị cô quay chân không 20 L. Phần dịch cặn (cao chiết etanol, 1,2kg ) được chiết nhiều lần bằng n-hexan (1 x 1 L + 3 x 0,6 L) để loại các chất không phân cực. Phần cặn nước còn lại được chiết 5 lần với etyl acetate(1 x 0,5 L + 4 x 1 L ), kiểm tra SKLM đến hết astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết EtOAc lại, quay cất loại bớt dung môi sau đó được tủa bằng các dung môi khác nhau thu được 144 g astilbin (TPL-As40) và các phân đoạn TPL-Đường (62 g), cặn chất trên astilbin (48 g) như trong sơ đồ tạo các cao chiết dưới đây (Hình 3.6).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6: Sơ đồ tạo cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40, TPL-Đƣờng 3.2. Xác định hàm lƣợng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40
3.2.1. Thiết lập thông số cho sắc ký lỏng
Các lựa chọn cho hệ dung môi:
- Các hệ dung môi: Metanol/nước (30:70, v/v), acetonitrile/nước (25:75, v/v) - Hệ đệm: axit acetic 0.3%
Rễ Thổ phục linh
(10 kg)
Cao chiết etanol TPL-EtOH (1,2 kg) Dịch nước Dịch chiết n-hexan Dịch chiết EtOAc Cao chiết n- hexan (60 g) Kết tủa TPL-Đường 62 g Kết tủa TPL-As40 144 g Dung dịch Chất trên lẫn astibin
- Ngâm chiết bằng etanol (1 x 40 L + 4 x 30 L ) - Chiết, lọc lấy dịch, cô cất loại dung môi
- Pha loãng với nước theo tỉ lệ (1: 1; V/Vml) - Chiết bằng n- hexan (1 x 1 L + 3 x 0,6 L)
Chiết bằng EtOAc (1 x 1,5 L + 3 x 0,2 L ) Quay cất loại dung môi
Tủa tách phân đoạn loại đường, thu sản phẩm Quay cất loại dung môi Cặn Chất trên astibin 48 g Loại dung môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các lựa chọn cột sắc ký:
- Cột Zobax eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 5µm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent.
- Cột Zobax extend C18 (4,6 x 250mm, 5µm) cột bảo vệ C18 của hãng Agilent Bước sóng được lựa chọn: 191 nm
Lựa chọn các thông số khác: Nhiệt độ 25oC; Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; Lượng mẫu bơm 5µl; Thời gian chạy 40 phút.
3.2.2. Thiết lập chương trình chạy
Chạy gradient: Hệ thống sắc ký phân tích được thử nghiệm ban đầu với hệ dung môi hữu cơ, tỷ lệ dung hệ dung môi được lựa chọn qua các bước tối ưu hóa.
3.2.3. Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng
Bước đầu thiết lập các thông số:
- Cột sắc ký được lựa chọn là cột zobax eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 5µm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent và cột Cột Zobax extend C18 (4,6 x 250 mm, 5µm) cột bảo vệ C18 của hãng Agilent
- Hệ dung môi hữu cơ ban đầu là MeOH và ACN, hệ đệm axit acetic
0,3%. Thành phần của pha động bao gồm kênh (C) methanol, kênh (D) nước và 0,3% axit acetic. Điều kiện chạy là gradient với tỉ lệ pha động ban đầu MeOH:H2O (0,3% aixit acetic) 30/70 (v/v).
- Bước sóng quét 191 nm.
- Các điều kiện khác: Nhiệt độ 25o
C; Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; Lượng mẫu bơm 5 µl; Thời gian chạy 40 phút
Các điều kiện tối ưu cho hệ sắc ký lỏng cao áp:
Qua các lựa chọn trong bước tối ưu ở trên, điều kiện tối ưu cho các thông số của hệ sắc ký lỏng cao áp như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Sử dụng cột zobax eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 5 µm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent.
- Hệ dung môi sử dụng methanol/nước (0.3% axit acetic), chương trình chạy theo Bảng 1.
- Thời gian chạy 40 phút; Tốc độ dòng 0.5 ml/phút; Bước sóng lựa chọn phân tích 191 nm; Lượng mẫu bơm 5µl; Nhiệt độ cột 25o
C.
Bảng 3.2: Hệ dung môi phân tích mẫu theo thời gian Thời gian (phút) MeOH H2O (axit acetic 0.3%)
0 30 70 5 30 70 10 40 60 20 50 50 25 100 0 30 100 0 40 30 70
3.2.4. Thiết lập trình tự chạy cho các mẫu
Các mẫu được thiết lập trình tự chạy theo chương trình Sequence của phần mềm Chemstation của Agilent Technologies. Tiến trình chạy được tóm tắt trên sơ đồ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.7: Sơ đồ trình tự chạy các mẫu
3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của hợp chất cần phân tích trong các mẫu
Công việc này được tiến hành trên hệ thống sắc ký lỏng Agilent 1200 Series kết nối đầu dò DAD theo quy trình sau:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu theo tiêu chuẩn phân tích
Bước 2: Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng Bước 3: Thiết lập điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng cao áp Bước 4: Thiết lập trình tự chạy mẫu cho hệ thống sắc ký lỏng cao áp Bước 5: Phân tích và sử lý số liệu
Xử lý số liệu: Các bước tính toán và xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm của máy HPLC.
Kiểm tra các điều kiện
Chạy mẫu trắng (blank)
Chạy mẫu
Chạy mẫu trắng (blank)
Số lượng mẫu >1 Rửa hệ thống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu TPL-EtOAc trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Hình 3.9: Sắc ký đồ của mẫu TPL- đƣờng trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.10: Sắc ký đồ của mẫu TPL-As40 trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Hình 3.11: Sắc ký đồ của mẫu TPL- EtOH trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả quan sát trên sắc ký đồ trên hình cho thấy thông tin thu nhận được rõ ràng, độ phân tách của các pic tăng, mật độ phân bố của các píc tương đối trải đều trên sắc ký đồ. Tiếp tục tiến hành tối ưu hóa chương trình radient, kết quả thu được không có sự thay đổi nhiều. Do đó, điều kiện thí nghiệm và gradient nêu trên được lựa chọn để xây dựng các sắc ký đồ của các mẫu thổ phục linh nhằm định tính và định lượng hợp chất astilbin.
3.3. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết
3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào các cao chiết TPL-EtOH,TPL-As40
Việc thử nghiệm hoạt tính độc tế bào được thực hiện tại phòng thử nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học. Cao chiết TPL-EtOH và chế phẩm TPL- As40 được thử hoạt tính độc tế bào với 3 dòng tế bào ung thư : Ung thư biểu mô (KB), ung thư phổi LU-1 và ung thư vú MCF-7.
Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu a, Vật liệu
- Hoá chất: do TS. Nguyễn Quốc Vượng, Viện HSB cung cấp và các
hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v. - Các dòng tế bào ung thư: do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học
Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
b, Phƣơng pháp
Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
- Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L- glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia