Mẫu rễ Thổ phục linh khô 10 kg được sấy khô, nghiền nhỏ và được cho vào trong thiết bị chiết thủy tinh có van khóa ở đáy, ethanol 85% (40 L) được cho vào và hỗn hợp được ngâm ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày với khuấy nhiều lần rồi tháo khóa lấy dịch chiết. Sau khi dịch chiết được tháo kiệt, ethanol 85% (30 L) được cho vào bình. Hỗn hợp được ngâm và lấy dịch chiết tương tự như vậy thêm 4 lần nữa (4 x 30 L), kiểm tra dịch chiết thấy không còn vết của astilbin thì dừng chiết. Các dịch chiết được kết hợp lại và quay cất loại dung môi trên thiết bị cô quay chân không 20 L. Phần dịch cặn (cao chiết etanol, 1,2kg ) được chiết nhiều lần bằng n-hexan (1 x 1 L + 3 x 0,6 L) để loại các chất không phân cực. Phần cặn nước còn lại được chiết 5 lần với etyl acetate(1 x 0,5 L + 4 x 1 L ), kiểm tra SKLM đến hết astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết EtOAc lại, quay cất loại bớt dung môi sau đó được tủa bằng các dung môi khác nhau thu được 144 g astilbin (TPL-As40) và các phân đoạn TPL-Đường (62 g), cặn chất trên astilbin (48 g) như trong sơ đồ tạo các cao chiết dưới đây (Hình 3.6).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6: Sơ đồ tạo cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40, TPL-Đƣờng 3.2. Xác định hàm lƣợng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40
3.2.1. Thiết lập thông số cho sắc ký lỏng
Các lựa chọn cho hệ dung môi:
- Các hệ dung môi: Metanol/nước (30:70, v/v), acetonitrile/nước (25:75, v/v) - Hệ đệm: axit acetic 0.3%
Rễ Thổ phục linh
(10 kg)
Cao chiết etanol TPL-EtOH (1,2 kg) Dịch nước Dịch chiết n-hexan Dịch chiết EtOAc Cao chiết n- hexan (60 g) Kết tủa TPL-Đường 62 g Kết tủa TPL-As40 144 g Dung dịch Chất trên lẫn astibin
- Ngâm chiết bằng etanol (1 x 40 L + 4 x 30 L ) - Chiết, lọc lấy dịch, cô cất loại dung môi
- Pha loãng với nước theo tỉ lệ (1: 1; V/Vml) - Chiết bằng n- hexan (1 x 1 L + 3 x 0,6 L)
Chiết bằng EtOAc (1 x 1,5 L + 3 x 0,2 L ) Quay cất loại dung môi
Tủa tách phân đoạn loại đường, thu sản phẩm Quay cất loại dung môi Cặn Chất trên astibin 48 g Loại dung môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các lựa chọn cột sắc ký:
- Cột Zobax eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 5µm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent.
- Cột Zobax extend C18 (4,6 x 250mm, 5µm) cột bảo vệ C18 của hãng Agilent Bước sóng được lựa chọn: 191 nm
Lựa chọn các thông số khác: Nhiệt độ 25oC; Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; Lượng mẫu bơm 5µl; Thời gian chạy 40 phút.
3.2.2. Thiết lập chương trình chạy
Chạy gradient: Hệ thống sắc ký phân tích được thử nghiệm ban đầu với hệ dung môi hữu cơ, tỷ lệ dung hệ dung môi được lựa chọn qua các bước tối ưu hóa.
3.2.3. Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng
Bước đầu thiết lập các thông số:
- Cột sắc ký được lựa chọn là cột zobax eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 5µm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent và cột Cột Zobax extend C18 (4,6 x 250 mm, 5µm) cột bảo vệ C18 của hãng Agilent
- Hệ dung môi hữu cơ ban đầu là MeOH và ACN, hệ đệm axit acetic
0,3%. Thành phần của pha động bao gồm kênh (C) methanol, kênh (D) nước và 0,3% axit acetic. Điều kiện chạy là gradient với tỉ lệ pha động ban đầu MeOH:H2O (0,3% aixit acetic) 30/70 (v/v).
- Bước sóng quét 191 nm.
- Các điều kiện khác: Nhiệt độ 25o
C; Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; Lượng mẫu bơm 5 µl; Thời gian chạy 40 phút
Các điều kiện tối ưu cho hệ sắc ký lỏng cao áp:
Qua các lựa chọn trong bước tối ưu ở trên, điều kiện tối ưu cho các thông số của hệ sắc ký lỏng cao áp như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Sử dụng cột zobax eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 5 µm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent.
- Hệ dung môi sử dụng methanol/nước (0.3% axit acetic), chương trình chạy theo Bảng 1.
- Thời gian chạy 40 phút; Tốc độ dòng 0.5 ml/phút; Bước sóng lựa chọn phân tích 191 nm; Lượng mẫu bơm 5µl; Nhiệt độ cột 25o
C.
Bảng 3.2: Hệ dung môi phân tích mẫu theo thời gian Thời gian (phút) MeOH H2O (axit acetic 0.3%)
0 30 70 5 30 70 10 40 60 20 50 50 25 100 0 30 100 0 40 30 70
3.2.4. Thiết lập trình tự chạy cho các mẫu
Các mẫu được thiết lập trình tự chạy theo chương trình Sequence của phần mềm Chemstation của Agilent Technologies. Tiến trình chạy được tóm tắt trên sơ đồ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.7: Sơ đồ trình tự chạy các mẫu
3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của hợp chất cần phân tích trong các mẫu
Công việc này được tiến hành trên hệ thống sắc ký lỏng Agilent 1200 Series kết nối đầu dò DAD theo quy trình sau:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu theo tiêu chuẩn phân tích
Bước 2: Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng Bước 3: Thiết lập điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng cao áp Bước 4: Thiết lập trình tự chạy mẫu cho hệ thống sắc ký lỏng cao áp Bước 5: Phân tích và sử lý số liệu
Xử lý số liệu: Các bước tính toán và xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm của máy HPLC.
Kiểm tra các điều kiện
Chạy mẫu trắng (blank)
Chạy mẫu
Chạy mẫu trắng (blank)
Số lượng mẫu >1 Rửa hệ thống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu TPL-EtOAc trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Hình 3.9: Sắc ký đồ của mẫu TPL- đƣờng trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.10: Sắc ký đồ của mẫu TPL-As40 trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Hình 3.11: Sắc ký đồ của mẫu TPL- EtOH trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả quan sát trên sắc ký đồ trên hình cho thấy thông tin thu nhận được rõ ràng, độ phân tách của các pic tăng, mật độ phân bố của các píc tương đối trải đều trên sắc ký đồ. Tiếp tục tiến hành tối ưu hóa chương trình radient, kết quả thu được không có sự thay đổi nhiều. Do đó, điều kiện thí nghiệm và gradient nêu trên được lựa chọn để xây dựng các sắc ký đồ của các mẫu thổ phục linh nhằm định tính và định lượng hợp chất astilbin.
3.3. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết
3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào các cao chiết TPL-EtOH,TPL-As40 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Việc thử nghiệm hoạt tính độc tế bào được thực hiện tại phòng thử nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học. Cao chiết TPL-EtOH và chế phẩm TPL- As40 được thử hoạt tính độc tế bào với 3 dòng tế bào ung thư : Ung thư biểu mô (KB), ung thư phổi LU-1 và ung thư vú MCF-7.
Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu a, Vật liệu
- Hoá chất: do TS. Nguyễn Quốc Vượng, Viện HSB cung cấp và các
hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v. - Các dòng tế bào ung thư: do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học
Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
b, Phƣơng pháp
Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
- Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L- glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Chất thử có hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0.8 g/ml; 0.16 g/ml.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.
- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180 l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 o
C. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
% sống sót = [OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)
% ức chế = 100% - % sống sót
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml.
- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT.
3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa
Việc thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết TPL-EtOH và TPL-As40 được thực hiện tại phòng thử nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học.
a, Vật liệu
Hoạt chất: TPL-EtOH dạng bột màu vàng đen, dễ chảy rữa; TPL-As40
chất bột màu vàng nhạt.
Hoá chất: DMSO, MTT, H2O2, Cucurmin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Động vật: chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không mắc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Dụng cụ thí nghiệm: đĩa nhựa 96 giếng, pipet, eppendorfvà các thiết bị
phụ trợ khác.
Thiết bị: Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader, Box cấy vô trùng
b, Phƣơng pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột
Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan. Khử trùng và giết chết chuột bằng cồn 70oC, tách lấy gan. Rửa gan bằng dung dịch PBS có 10% kháng sinh. Dùng panh, kéo, kim tiêm gạt, tách tế bào gan trong PBS. Thu dịch có tế bào gan, li tâm, loại bỏ dịch nổi. Hoà cặn tế bào trong NH4Cl, li tâm thu cặn tế bào, cho môi trường MEME có 10% FBS và các thành phần cần thiết khác. Nuôi trong tủ ấm ở 37o
C, 5% CO2.
c, Phép thử sinh học kiểm tra khả năng chống oxy hoá của hoạt chất trên tế bào gan
Tế bào gan sau phân lập được nuôi ổn định 1-2 ngày, sau đó đưa vào đĩa 96 giếng với mật độ 1 x 104
tế bào/giếng, nuôi qua đêm trong tủ ấm 5% CO2, ở 37o
C.
Thêm hoạt chất nghiên cứu hoặc Cucurmin (đối chứng dương) ở các nồng độ khác nhau, ủ trong 2 giờ.
Thêm 100 M H2O2 vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ. Cho 50 l/giếng MTT nồng độ 1mg/ml, ủ trong 4 giờ.
Loại bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi giếng 100 l DMSO 100%.
Đo mật độ quang học (OD) bằng máy Microplate Reader ở 492 nm.
% sống sót = [OD(chất thử) - OD(H2O2)] x 100 OD(Tế bào) - OD(H2O2)
Giá trị ED50 (nồng độ bảo vệ được 50% đối với sự sống sót của tế bào) được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2D phiên bản số 4 và Excell để tính giá trị Standard Deviation. Độ chính xác của số liệu được tính bằng R2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Astilbin và một số hoạt chất tách đƣợc từ rễ Thổ phục linh
Astilbin và một số hợp chất cạnh nó trên SKLM là những hợp chất khó phân lập ra khỏi astilbin, tuy nhiên chúng đã được tách theo phương pháp chung như trình bày trong sơ đồ hình 3.1. Rễ thổ phục linh khô đã được nghiền nhỏ (500 g) được ngâm chiết với cồn 85% nhiều lần và được kiểm tra SKLM để đảm bảo đã chiết kiệt astilbin trong mẫu chiết. Sau đó kết hợp các dịch chiết lại rồi quay cất loại dung môi thu được cao chiết tổng TPL-EtOH. Cao chiết TPL-EtOH được loại bớt các phần không phân cực bằng việc tạo huyền phù với nước theo tỉ lệ (1:1, v/v) sau đó chiết nhiều lần với n-hexan. Phần dịch nước còn lại được chiết với etyl axetat nhiều lần đảm bảo chiết kiệt astilbin trong dịch nước (kiểm tra bằng SKLM). Dịch etyl axetat được kết hợp lại rồi quay cất loại dung môi thu được cặn chiết etyl axetat. Cặn chiết này được tách bằng sắc cột trên silicagen với hệ dung môi rửa giải n-hexane : EtOAc với các tỉ lệ tăng đần EtOAc để thu được astilbin tương đối sạch và các phần dung dịch gồm: Các chất trên astilbin (0,5 g) + Các chất trên astilbin lẫn astilbin (2 g) + Astilbin tương đối sạch (5,43 g) + Astilbin lẫn các chất dưới (3,07 g) + Các chất dưới astilbin (3 g).
- Phân đoạn astilbin lẫn chất trên được tách qua sắc ký cột trên silicagen
lặp lại nhiều lần thu được hợp chất dihydrokaempferol-3-O-L-
rhamnopyranoside (Chất 2).
- Phân đoạn astilbin lẫn chất dưới được tách qua cột sắc ký trên silicagen pha thường, silicagen pha đảo, sephadex thu được chất ngay sát dưới astilbinmàu đỏ là 3-O-caffeoyl-shikimic acid (0,045g) ( Chất 3).
Các hợp chất phân lập được từ rễ Thổ phục linh được trình bày trong bảng 4.1:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 4.1: Cấu trúc phân tử của 3 hợp chất tách đƣợc rễ Thổ phục linh
Chất Công thức cấu tạo Tên chất
1 Astilbin (Taxifolin-3-O-L- rhamnopyranoside) 2 Engeletin (Dihydrokaempferol-3- O-L-rhamnopyranoside) 3 3-O-caffeoyl-shikimic acid (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Biện luận cấu trúc phân tử các hợp chất đã tách
Chất 1 : Astilbin (Taxifolin 3-O-L-rhamnopyranoside):
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các dữ liệu phổ của sản phẩm astilbin phân lập phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ của hợp chất này trong các tài liệu đã được công bố. Phổ khối ion hóa phun mù điện tử cho pic ion giả phân tử [M-H+2H2O]- với m/z= 486 phù hợp với trọng lượng phân tử của astilbin. Trên phổ proton 1
H-NMR của sản phẩm astilbin tại vùng trường thấp xuất hiện cụm tín hiệu của 3 proton vòng thơm B ở δ6,98 (1H, d, J=1,8Hz), ở δ6,86 (1H, dd, J = 8,2 Hz, và 1,8 Hz) và 6,82(1H, d, J = 8,1 Hz) cho thấy vòng B đã bị thế vào 2 vị trí C-3‟ và 4‟). Ở trường cao hơn 2 tín hiệu duplet ở 5,94ppm (1H, d, J= 2,1Hz) và tín hiệu ở 5,92(1H, d ,J= 2,1Hz) là các tương tác proton vị trí meta