3.1.2.1. Thu mua Thổ phục linh tại các vùng khảo sát
Thổ phục linh Việt Nam được mua tại 8 tỉnh và thành phố ở miền Bắc là
Thái Nguyên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Quảng Ninh, Sapa, Sơn La, Hòa Bình. Các mẫu Thổ phục linh các vùng được trình bày trong các hình dưới đây:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu TPL Sơn La Mẫu TPL Hòa bình
Mẫu TPL Thái Nguyên Mẫu TPL Tuyên Quang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu TPL Vĩnh Phúc Mẫu TPL Sapa
Hình 3.2: Hình ảnh các mẫu Thổ phục linh ở các vùng
3.1.2.2. Quy trình chung phân lập và xác định hàm lượng astilbin từ rễ Thổ phục linh khô phục linh khô
Mẫu rễ Thổ phục linh khô (500g), được sấy khô, nghiền nhỏ và được ngâm, chiết trong ethanol 85% bằng siêu âm trong 30 phút ở 50o
C. Quá trình đuợc tiến hành 5 lần (1 x 1,8 L; 4x1 L) ( kiểm tra SKLM thấy không còn astilbin) gộp các dịch chiết lại rồi quay cất chân không thấp loại dung môi. Phần cặn nước còn lại được chiết với n-hexan (3x 0,05 L) để loại các chất trên. Phần dịch nước được chiết 5 lần với ethyl acetate ( 1 x 0,05 L + 3 x 0,02 L) kiểm tra SKLM đến hết astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết EtOAc lại, quay cất loại dung môi sau đó phần cặn EtOAc được tách bằng SKC trên silicagen thu được gồm: astilbin thô có lẫn dạng vết của chất trên và chất dưới; phần chất dưới lẫn astilbin; phân chất trên lẫn astilbin;
-Astilbin thô được kết tinh lại trong MeOH: H2O (1:1, v/v) cho astilbin khoảng 95%.
-Phần chất dưới lẫn astilbin và phần chất trên lẫn astilbin được tách tại bằng SKC trên silicagen thu được thêm astilbin có độ sạch tương đối được kết tinh lại cho astilbin có hàm lượng khoảng 95% theo HPLC.
-Hàm lượng astilbin trong rễ thổ phục linh được tính bằng tổng lượng astilbin thu được từ 3 phân đoạn tách trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3: Sơ đồ phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh khô
Rễ Thổ phục linh
(500 g)
Cao chiết etanol
Dịch nước Dịch chiết
n-hexan
Cao chiết EtOAc Cao chiết
n-hexan Astilbin lẫn chất dưới Chất Astilbin thô Astilbin lẫn chất trên Astilbin tổng
- Ngâm chiết bằng etanol (1 x 1,8 L + 4 x 1 L ) - Chiết, lọc lấy dịch, cô cất loại dung môi
- Pha loãng với nước theo tỉ lệ (1: 1; V/Vml) - Chiết bằng n- hexan (3 x 0,05 L)
Chiết bằng EtOAc (2 x 0,05 L + 3 x 0,02 L ) Quay cất loại dung môi
Tách SKC trên silicagen Hệ dung môi tách n-Hexane : EtOAc
Tách SKCtrên: - silicagen, - pha đảo - sephadex Quay cất loại dung môi Kết tinh Tách SKC Trên silicagen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.3. Giám định thu mua mẫu và xử lý mẫu Thổ phục linh 3.1.3.1. Giám định mẫu thực vật 3.1.3.1. Giám định mẫu thực vật
Sau khi đã khảo sát vùng nguyên liệu về hàm lượng astilbin ở các vùng và khả năng thu mua mẫu lượng lớn ở các vùng chúng tôi đã chọn vùng nguyên liệu cho thu mua mẫu là tỉnh Tuyên Quang. Để giám định mẫu thực vật, mẫu cây bao gồm: củ, thân cành lá đã được thu thập tại Tuyên Quang và được giám định mẫu tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, do PGS. TS. Trần Huy Thái và TS. Nguyễn Thế Cường giám định (có kèm theo văn bản “Kết quả giám định tên khoa học”).
Hình : Thổ phục linh tươi Hình : Củ Thổ phục linh tươi
Hình 3.4: Mẫu Thổ phục linh thân lá và củ tƣơi
Mẫu thực vật được giám định thuộc loài Smilaxg glabra Roxb., họ Smilacaceae.
3.1.3.2. Thu mua và xử lý mẫu
Mẫu rễ Thổ phục linh tươi (200 kg) thu mua tại Tuyên Quang được rửa sạch, để ráo nước, rồi đem thái mỏng và phơi khô trong vài ngày sau đó sấy trên tủ sấy thường ở 400
C trong 2 ngày đến khô hẳn rồi để nguội cân được 65 kg. Thổ phục linh lát mỏng khô được đóng bao trong túi polyethylene kín và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
được sấy lại trước khi nghiền thành bột. Một số hình ảnh về mẫu Thổ phục linh tươi được thu mua tại Tuyên Quang, được trình bày trong hình 3.5.
Củ tươi TPL TPL thái mỏng
Hình 3.5: Hình ảnh mẫu Thổ phục linh tƣơi tại Tuyên Quang
3.1.4. Tạo các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40
Mẫu rễ Thổ phục linh khô 10 kg được sấy khô, nghiền nhỏ và được cho vào trong thiết bị chiết thủy tinh có van khóa ở đáy, ethanol 85% (40 L) được cho vào và hỗn hợp được ngâm ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày với khuấy nhiều lần rồi tháo khóa lấy dịch chiết. Sau khi dịch chiết được tháo kiệt, ethanol 85% (30 L) được cho vào bình. Hỗn hợp được ngâm và lấy dịch chiết tương tự như vậy thêm 4 lần nữa (4 x 30 L), kiểm tra dịch chiết thấy không còn vết của astilbin thì dừng chiết. Các dịch chiết được kết hợp lại và quay cất loại dung môi trên thiết bị cô quay chân không 20 L. Phần dịch cặn (cao chiết etanol, 1,2kg ) được chiết nhiều lần bằng n-hexan (1 x 1 L + 3 x 0,6 L) để loại các chất không phân cực. Phần cặn nước còn lại được chiết 5 lần với etyl acetate(1 x 0,5 L + 4 x 1 L ), kiểm tra SKLM đến hết astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết EtOAc lại, quay cất loại bớt dung môi sau đó được tủa bằng các dung môi khác nhau thu được 144 g astilbin (TPL-As40) và các phân đoạn TPL-Đường (62 g), cặn chất trên astilbin (48 g) như trong sơ đồ tạo các cao chiết dưới đây (Hình 3.6).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6: Sơ đồ tạo cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40, TPL-Đƣờng 3.2. Xác định hàm lƣợng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40
3.2.1. Thiết lập thông số cho sắc ký lỏng
Các lựa chọn cho hệ dung môi:
- Các hệ dung môi: Metanol/nước (30:70, v/v), acetonitrile/nước (25:75, v/v) - Hệ đệm: axit acetic 0.3%
Rễ Thổ phục linh
(10 kg)
Cao chiết etanol TPL-EtOH (1,2 kg) Dịch nước Dịch chiết n-hexan Dịch chiết EtOAc Cao chiết n- hexan (60 g) Kết tủa TPL-Đường 62 g Kết tủa TPL-As40 144 g Dung dịch Chất trên lẫn astibin
- Ngâm chiết bằng etanol (1 x 40 L + 4 x 30 L ) - Chiết, lọc lấy dịch, cô cất loại dung môi
- Pha loãng với nước theo tỉ lệ (1: 1; V/Vml) - Chiết bằng n- hexan (1 x 1 L + 3 x 0,6 L)
Chiết bằng EtOAc (1 x 1,5 L + 3 x 0,2 L ) Quay cất loại dung môi
Tủa tách phân đoạn loại đường, thu sản phẩm Quay cất loại dung môi Cặn Chất trên astibin 48 g Loại dung môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các lựa chọn cột sắc ký:
- Cột Zobax eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 5µm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent.
- Cột Zobax extend C18 (4,6 x 250mm, 5µm) cột bảo vệ C18 của hãng Agilent Bước sóng được lựa chọn: 191 nm
Lựa chọn các thông số khác: Nhiệt độ 25oC; Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; Lượng mẫu bơm 5µl; Thời gian chạy 40 phút.
3.2.2. Thiết lập chương trình chạy
Chạy gradient: Hệ thống sắc ký phân tích được thử nghiệm ban đầu với hệ dung môi hữu cơ, tỷ lệ dung hệ dung môi được lựa chọn qua các bước tối ưu hóa.
3.2.3. Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng
Bước đầu thiết lập các thông số:
- Cột sắc ký được lựa chọn là cột zobax eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 5µm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent và cột Cột Zobax extend C18 (4,6 x 250 mm, 5µm) cột bảo vệ C18 của hãng Agilent
- Hệ dung môi hữu cơ ban đầu là MeOH và ACN, hệ đệm axit acetic
0,3%. Thành phần của pha động bao gồm kênh (C) methanol, kênh (D) nước và 0,3% axit acetic. Điều kiện chạy là gradient với tỉ lệ pha động ban đầu MeOH:H2O (0,3% aixit acetic) 30/70 (v/v).
- Bước sóng quét 191 nm.
- Các điều kiện khác: Nhiệt độ 25o
C; Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; Lượng mẫu bơm 5 µl; Thời gian chạy 40 phút
Các điều kiện tối ưu cho hệ sắc ký lỏng cao áp:
Qua các lựa chọn trong bước tối ưu ở trên, điều kiện tối ưu cho các thông số của hệ sắc ký lỏng cao áp như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Sử dụng cột zobax eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 5 µm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent.
- Hệ dung môi sử dụng methanol/nước (0.3% axit acetic), chương trình chạy theo Bảng 1.
- Thời gian chạy 40 phút; Tốc độ dòng 0.5 ml/phút; Bước sóng lựa chọn phân tích 191 nm; Lượng mẫu bơm 5µl; Nhiệt độ cột 25o
C.
Bảng 3.2: Hệ dung môi phân tích mẫu theo thời gian Thời gian (phút) MeOH H2O (axit acetic 0.3%)
0 30 70 5 30 70 10 40 60 20 50 50 25 100 0 30 100 0 40 30 70
3.2.4. Thiết lập trình tự chạy cho các mẫu
Các mẫu được thiết lập trình tự chạy theo chương trình Sequence của phần mềm Chemstation của Agilent Technologies. Tiến trình chạy được tóm tắt trên sơ đồ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.7: Sơ đồ trình tự chạy các mẫu
3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của hợp chất cần phân tích trong các mẫu
Công việc này được tiến hành trên hệ thống sắc ký lỏng Agilent 1200 Series kết nối đầu dò DAD theo quy trình sau:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu theo tiêu chuẩn phân tích
Bước 2: Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng Bước 3: Thiết lập điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng cao áp Bước 4: Thiết lập trình tự chạy mẫu cho hệ thống sắc ký lỏng cao áp Bước 5: Phân tích và sử lý số liệu
Xử lý số liệu: Các bước tính toán và xử lý số liệu được thực hiện trên phần mềm của máy HPLC.
Kiểm tra các điều kiện
Chạy mẫu trắng (blank)
Chạy mẫu
Chạy mẫu trắng (blank)
Số lượng mẫu >1 Rửa hệ thống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu TPL-EtOAc trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Hình 3.9: Sắc ký đồ của mẫu TPL- đƣờng trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.10: Sắc ký đồ của mẫu TPL-As40 trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Hình 3.11: Sắc ký đồ của mẫu TPL- EtOH trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150mm, 5µm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả quan sát trên sắc ký đồ trên hình cho thấy thông tin thu nhận được rõ ràng, độ phân tách của các pic tăng, mật độ phân bố của các píc tương đối trải đều trên sắc ký đồ. Tiếp tục tiến hành tối ưu hóa chương trình radient, kết quả thu được không có sự thay đổi nhiều. Do đó, điều kiện thí nghiệm và gradient nêu trên được lựa chọn để xây dựng các sắc ký đồ của các mẫu thổ phục linh nhằm định tính và định lượng hợp chất astilbin.
3.3. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết
3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào các cao chiết TPL-EtOH,TPL-As40
Việc thử nghiệm hoạt tính độc tế bào được thực hiện tại phòng thử nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học. Cao chiết TPL-EtOH và chế phẩm TPL- As40 được thử hoạt tính độc tế bào với 3 dòng tế bào ung thư : Ung thư biểu mô (KB), ung thư phổi LU-1 và ung thư vú MCF-7.
Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu a, Vật liệu
- Hoá chất: do TS. Nguyễn Quốc Vượng, Viện HSB cung cấp và các
hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v. - Các dòng tế bào ung thư: do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học
Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
b, Phƣơng pháp
Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
- Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L- glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Chất thử có hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0.8 g/ml; 0.16 g/ml.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.
- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180 l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 o
C. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
% sống sót = [OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)
% ức chế = 100% - % sống sót
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml.
- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT.
3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa
Việc thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết TPL-EtOH và TPL-As40 được thực hiện tại phòng thử nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học.
a, Vật liệu
Hoạt chất: TPL-EtOH dạng bột màu vàng đen, dễ chảy rữa; TPL-As40
chất bột màu vàng nhạt.
Hoá chất: DMSO, MTT, H2O2, Cucurmin.
Động vật: chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không mắc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Dụng cụ thí nghiệm: đĩa nhựa 96 giếng, pipet, eppendorfvà các thiết bị
phụ trợ khác.
Thiết bị: Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader, Box cấy vô trùng
b, Phƣơng pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột
Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan. Khử