- Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quyết Chiến và G.Adam thì trong dịch chiết MeOH của rễ cây Thổ phục linh có dihydrokaempferol 3-O-α-L- rhamno-pyranosit và astilbin, trong đó astilbin có hàm lượng khá cao [18]. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học đã cho thấy Thổ phục linh có nhiều hoạt tính sinh học giá trị.
- Viện Ung thư,bệnh viên đại học Bắc Kinh, Trung Quốc đã nghiên cứu thành công tác dụng chống ung thư của Smilax glabra Roxb: Thổ phục linh có chất làm ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú, đại tràng, ung thư tế bào dòng HT-29 và ung thư dạ dày. Thí nghiệm được thực hiện trên 10 chú chuột bạch và đã cho kết quả tốt. [23]
-Năm 2003, nhóm nghiên cứu trường Đại học Hồng Kông, Trung Quốc đã nghiên cứu thành công và cho ra các chất có hoạt tính sinh học cao được chiết từ Thổ PhụcLinh: flavonoid, taxifolin, neoastilbin, astilbin, neoisoastilbin và isoastilbin. Li và cộng sự đã xác định astilbin chứa trong thân rễ bằng phương pháp sắc ký lỏng – pha đảo. Chen và cộng sự cũng đã xác định astilbin bằng phương pháp sắc ký lỏng. 12 mẫu Thổ phục linh từ các vùng khác nhau của Trung Quốc được xác định hàm lượng astilbin dao động khoảng từ 1 – 4%.
- Cùng với những nghiên cứu về hoạt tính sinh học, những phát hiện mới về các hoạt chất trong rễ Thổ phục linh cũng vẫn đang được công bố. Năm 1996, Tạp chí dược liệu Trung Quốc đã công bố 3 chất glucosides flavanonol gồm isoengetitin, isoastilbin và astilbin được phân lập từ thân rễ cây Thổ phục linh [23]. Năm 1999, Chen và cộng sự công bố đã phân lập được flavanone mới từ cây Thổ phục linh [8]. Đến năm 2000, nhóm nghiên cứu này cũng công bố đã phân lập được phenylpropanoid glycosides cũng từ cây Thổ phục linh [9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Mới đây nhất là công bố của Xu và cộng sự (năm 2013) đã phân lập được 6 cấu tử phenolic mới là: smiglabrome A (1), smiglabrome B (2), smilachromanone (3), smiglastibene (4), smiglactone (5), smiglabrol (6) và 57 cấu tử đã biết khác được tách ra từ rễ cây Thổ phục linh. [21]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phƣơng pháp tạo các cao chiết và phân lập các hoạt chất
2.1.1. Phương pháp tạo cao chiết
Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là: sự hòa tan của chất tan vào dung môi, sự khuyếch tán của chất tan trong dung môi và sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật.
Mỗi loại hợp chất có độ hoà tan khác nhau trong từng loại dụng môi tùy thuộc vào độ phân cực của hợp chất đó. Khi bắt đầu chiết một dược liệu để nghiên cứu thì thăm dò từ các loại dung môi kém phân cực đến phân cực mạnh để chiết phân đoạn các chất ra khỏi dược liệu.
Các kỹ thuật và thiết bị chiết như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngâm kiệt ở nhiệt độ thường), chiết ở nhiệt độ cao ( chiết nóng, hãm, sắc, ngâm kiệt nóng), chiết với các thiết bị như Soxhlet, kumagawa… Hoặc có kèm các thiết bị hỗ trợ như máy siêu âm, thiết bị vi sóng…Cách chiết thông dụng là chiết nóng bằng máy chiết liên tục (Soxhlet). Sau mỗi lần chiết với một loại dung môi cần làm khô dược liệu rồi mới tiếp tục chiết với loại dụng môi tiếp theo. Mỗi phân đoạn chiết được cất thu hồi dung môi và tiến hành phân tích riêng.
Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết. Như: Trong phân đoạn chiết ete dầu hỏa và n-hexan sẽ có các hydro cacbon béo hoặc thơm, các thành phần của tinh dầu như monotecpen, các chất không phân cực như chất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
béo, caroten, các sterol, các chất màu thực vật, chlorophyl (chất diệp lục). Trong dịch chiết cồn sẽ có mặt glycozit, ancaloit, flavonoit, các hợp chất phenol khác, nhựa, axít hữu cơ, tanin. Trong dịch chiết nước sẽ có các glucozit, tanin, các đường, các hợp chất hydrat cacbon phân tử vừa như pectin, các protein thực vật và muối vô cơ.
Khi cần chiết lấy đa số thành phần trong dược liệu thì dung môi thích hợp nhất là cồn 85% hoặc metanol.
2.1.2. Các phương pháp phân lập
2.1.2.1. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography- TLC)
Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn- lỏng. Đây là một phương pháp hiện đại, được sử dụng rỗng rãi trong các ngành hóa học, hóa sinh, hóa dược… Với các mục đích khác nhau để tách các cấu tử vô cơ hoặc hữu cơ với độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ, thời gian phân tích ngắn,khả năng phân tách tốt, kỹ thuật tiến hành đơn giản và chi phí thấp. Phương pháp TLC có thể để dùng định tính hay định lượng hoặc để kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các phương pháp sắc ký khác như sắc ký cột để tìm hệ dung môi thích hợp cho sự phân tách.
Trong phương pháp sắc ký lớp mỏng thì pha động là chất lỏng được đi xuyên qua (pha tĩnh) một lớp chất hấp thụ trơ như: silicagen hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic. Hiện nay có thể dùng các bản mỏng tráng sẵn lớp chất hấp thụ được bán trên thị trường như bản mỏng silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) trên nền nhôm.
Quan sát phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm. Hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được nhúng đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu, quan sát vệt chất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.1.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC)
Sắc ký lớp mỏng điều chế là một phương pháp sắc ký được sử dụng để tách một lượng nhỏ đơn chất (10 – 1000 mg) từ một hỗn hợp đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử). Trong PTLC, một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxyd) có độ dày từ 0,5 – 2,0 mm tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau. Sau khi khai triển, ta có thể thu được những cấu tử đặc trưng bằng cách cạo vùng chất hấp phụ chứa vết ra khỏi bản và phản hấp phụ chất ra khỏi giá hấp phụ bằng một dung môi thích hợp. Hợp chất thu được từ bản mỏng có thể được tinh khiết hóa tiếp tục bằng sắc ký lớp mỏng hay các phương pháp sắc ký khác hoặc hợp chất này đã đạt độ tinh khiết để tiến hành định tính, xác định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích cơ bản hay bằng phép đo quang phổ, nghiên cứu hoạt tính sinh học, nghiên cứu tổng hợp hóa học, sử dụng như chất chuẩn đối chiếu.
Phương pháp tiến hành của PTLC nhìn chung tương tự như TLC chỉ khác ở việc sử dụng những bản mỏng dày hơn so với TLC: PTLC 0,5 – 2 mm, có thể dày đến 10 mm tùy yêu cầu sử dụng; TLC 0,2 – 0,25 mm.
Với phương pháp này thì các hợp chất kém bền chấm trên bề mặt bản mỏng có thể bị phân hủy khi tiếp xúc với không khí và ánh sáng. Sự hiện diện đồng thời của tạp chất khi phản hấp phụ chất mong muốn ra khỏi giá hấp phụ. Dung môi sử dụng trong phương pháp PTLC thường là loại dung môi có độ tinh khiết cao, tránh chứa các vết kim loại, không quá dễ bay hơi.
Các bản mỏng chế hóa có thể tự làm trong phòng thí nghiệm (bản mỏng tự tráng) hoặc sử dụng những bản mỏng tráng sẵn. Dùng các chất hấp phụ tạo hỗn dịch bền trong nước (có thể thêm một lượng nhỏ chất trơ như thạch cao để kết dính nếu cần) rồi tráng lên tấm kính phẳng thành các bản có độ dày 0,5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
– 2,0 mm (có thể dày đến 10 mm) tùy yêu cầu sử dụng. Để khô bản ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày, sau đó sấy sơ bộ 600
C trong 2h rồi mới sấy hoạt hóa ở 1200C trong 2h.
Chuẩn bị mẫu thử (đã được sơ bộ loại tạp) được cô ở áp suất giảm đến khô, sau đó hòa vào trong một lượng vừa đủ dung môi (phải hòa tan tốt mẫu thử và dễ bay hơi) rồi chấm lên bản mỏng. Đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới 1 – 2 cm.
Cách phát hiện trong sắc ký lớp mỏng điều chế: soi UV, phun thuốc thử lên phần không bị che, sử dụng hơi iod.
2.1.2.3. Sắc ký cột (Column chromatography- CC)
Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất tùy theo các tính chất hóa lý của chúng. Trong phương pháp sắc ký cột, pha tĩnh thường là silicagen được nhồi vào cột sau đó hỗn hợp chất hoà tan trong dung môi hữu cơ được đưa lên cột sắc ký. Dùng dung môi tinh khiết để rửa giải để tách các chất ra khỏi nhau.
Đây là phương pháp được ứng dụng phổ biến nhất để phân tách các chất trong một hỗn hợp dựa vào sự khác nhau về độ phân cực của chúng. Khi dung môi kém phân cực đi qua cột sắc ký, những phần kém phân cực sẽ bị rửa giải đi ra cùng dung môi, những phần phân cực hơn chỉ đi qua khi dung môi được đưa vào có độ phân cực cao hơn.
Trong sắc ký cột dung môi dùng để rửa giải thường là n-hexan, axeton, etylaxetat, điclometan, metanol.
2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc
2.2.1. Phổ hồng ngoại (Infrared - IR)
Phổ hồng ngoại được ghi trên máy đo hồng ngoại biến đổi Fourier hiệu FTIR Impact- 410 bằng phương pháp nén KBr.
Do các nhóm chức trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong các vùng từ 10000 đến 100cm-1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
dao động của phân tử. Sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại có định lượng nhưng phổ hồng ngoại không biểu hiện thành các đường thẳng mà là các dải hấp thụ với cường độ khác nhau bởi vì sự biến đổi năng lượng dao động luôn đi kèm với sự biến đổi năng lượng dao động quay.
Phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ 2 dạng năng lượng đó là năng lượng dao động và năng lượng quay.
Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của các nguyên tử, hằng số lực các dãy nối và cấu trúc hình học của nguyên tử.
Như vậy, phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm chức có trong phân tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức đó.
2.2.2. Phổ tử ngoại (UV-VIS)
Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Sự hấp thụ ấy gây ra sự chuyển dịch các điện tử từ obitan ở trạng thái cơ bản lên obitan có năng lượng cao hơn ở trạng thái kích thích.
Chỉ có một số dạng cấu trúc trong hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ ấy nên trên thực tế phổ tử ngoại cũng chỉ giới hạn trong một số hợp chất, chủ yếu là các chất có cấu trúc liên kết π liên hợp.
Đặc điểm của phổ tử ngoại là phổ của một chất phức tạp có thể giống với phổ của một chất đơn giản nếu 2 chất ấy cùng chứa một nhóm cấu trúc giống nhau.
2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance, viết tắt là NMR) là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hoá học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thông số đặc trưng liên quan đến cấu trúc hoá học của một phân tử là độ chuyển dịch hoá học δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đó.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với TMS (Tetrametylsilan) là chất chuẩn nội.
2.2.4. Phổ khối lượng (Mass spectrometry- MS)
Phổ khối lượng là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+, [M+H]+, [M-H]- ..., từ đó giúp ta xây dựng công thức phân tử.
Phổ khối lượng được đo bằng phương pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. Phƣơng pháp HPLC xác định hàm lƣợng các hợp chất
Sử dụng phương pháp Sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) để định lượng hợp chất.
- Cách tiến hành:
+ Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 0,8 mg/ml đã chuẩn bị ở trên, độ lệch chuẩn tương đối của các diện tích đáp ứng từ 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0 %.
+ Tiêm riêng biệt các dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận các sắc ký đồ. Thiết lập đường chuẩn của astilbin giữa nồng độ dung dịch (mg/ml) và diện tích pic tương ứng theo phương trình y = ax + b.
+ Tiêm dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ. Tính nồng độ C (mg/ml) hoạt chất trong dung dịch thử dựa trên phương trình đường chuẩn đã xây dựng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hàm lượng hoạt chất có trong chế phẩm, tính theo chế phẩm khan, được tính theo công thức:
X (%) = C x D x 100 x 100
mc x (100 – a) Trong đó:
C: nồng độ của hoạt chất trong dung dịch thử (mg/ml) D: độ pha loãng của dung dịch thử
mc: lượng cân mẫu thử (mg) a: độ ẩm mẫu thử (%)
2.4. Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học của các cao chiết
2.4.1. Hoạt tính độc tế bào invitro 2.4.1.1. Nguyên liệu 2.4.1.1. Nguyên liệu
Các dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú).
Mẫu thử: các cao chiết.
2.4.1.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào invitro
Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM các thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyuvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS (GIBCO). Tế bào được cấy chuyển sau 3 – 5 ngày với tỉ lệ 1 : 3 và nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở điều kiện 370C.
2.4.1.3. Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay)
Các tế bào ung thư được nuôi trong phiến vi lượng 96 giếng, được thử chất, nhuộm bằng SRB (Sulforhodamine B) và đo hàm lượng protein tổng số ở bước sóng 515 nm bằng máy Microplate Reader (BioRad), đo hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density). Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Hoạt chất được chuẩn bị cho thí nghiệm ở các nồng độ 20 µg/ml; 4 µg/ml; 0,8 µg/ml; 0,16 µg/ml.
Dữ liệu sau đó được phân tích bằng bảng Excel và giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ phần mềm TableCurve phiên bản số 4.