Về nguyên tắc phân tích, khi đã định tính được píc nào trên sắc ký đồ tương ứng với chất nào và đã có sắc ký đồ của các mẫu chuẩn với những nồng độ khác nhau thì ta có thể tính ra nồng độ của chất cần phân tích bằng phương pháp đường chuẩn, cách thức làm như sau:
-Vẽ đồ thị của diện tích píc theo nồng độ, từ đó dùng phương pháp bình phương tối thiểu để suy ra đường hồi quy.
-Từ phương trình hồi quy dạng Y = AX + B trong đó Y là diện tích píc, X là nồng độ của chất phân tích, A,B là các hệ số hồi quy, căn cứ vào sắc ký đồ của mẫu ta có được Y của chất cần phân tích, dựa vào phương trình này ta sẽ suy ra được nồng độ của chất cần phân tích trên đường chuẩn.
-Từ nồng độ này, căn cứ vào khối lượng hay thể tích của mẫu cũng như các thể tích pha loãng thì sẽ suy ra được hàm lượng của chất cần phân tích trong các mẫu.
Trên cơ sở đó, từ dung dịch astilbin gốc nồng độ 1 mg/ml tiến hành pha loãng tạo các dãy dung dịch bằng dung môi. Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 15.256; 31.25; 62.5; 250; 500µg/ml (Bảng 4.3). Tiến hành lập danh sách các mẫu chạy theo thứ tự lần lượt từ nồng độ thấp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đến cao. Chạy Sequence với bơm tự động và chương trình chạy được lập trình bằng sự hỗ trợ của phần mềm Chemstation.
Trên sắc ký đồ UV của tất cả các mẫu astilbin đều cho tín hiệu ổn định tại thời gian lưu 19.0 phút. Chúng tôi đã tiến hành dựng đường chuẩn định lượng biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ dựa trên sắc ký đồ UV.
Hình 4.11: Sắc ký đồ của hợp chất astilbin tại bƣớc sóng 291 nm trên cột Zobax eclipse XDB C18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Từ các số liệu về diện tích píc và nồng độ tiến hành xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ có phương trình hồi quy tuyến tính là Y= 17857.54213X – 71.18024, có độ tin cậy cao (R2
= 0.9998). Kết quả được trình bày trên hình 4.12 và bảng 4.3.
Bảng 4.3: Đƣờng chuẩn, r2, LOD, LOQ của các chất Astilbin
Đường chuẩn r2 LOD (μg/ml) LOQ (μg/ml) Dải nồng độ (μg/ml) Astilbin Y= 17857.54213X - 71.18024 0.9998 7.8 15.625 15.625-500