2.4.1.1. Nguyên liệu
Các dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú).
Mẫu thử: các cao chiết.
2.4.1.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào invitro
Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM các thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyuvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS (GIBCO). Tế bào được cấy chuyển sau 3 – 5 ngày với tỉ lệ 1 : 3 và nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở điều kiện 370C.
2.4.1.3. Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay)
Các tế bào ung thư được nuôi trong phiến vi lượng 96 giếng, được thử chất, nhuộm bằng SRB (Sulforhodamine B) và đo hàm lượng protein tổng số ở bước sóng 515 nm bằng máy Microplate Reader (BioRad), đo hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density). Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Hoạt chất được chuẩn bị cho thí nghiệm ở các nồng độ 20 µg/ml; 4 µg/ml; 0,8 µg/ml; 0,16 µg/ml.
Dữ liệu sau đó được phân tích bằng bảng Excel và giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ phần mềm TableCurve phiên bản số 4.
DMSO 10% là dung môi pha chất được sử dụng như đối chứng âm. Ellipticine được sử dụng làm đối chứng dương ở các nồng 20 µg/ml; 4 µg/ml; 0,8 µg/ml; 0,16 µg/ml. Dữ liệu sau đó được phân tích bằng bảng Excel và giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ phần mềm TableCurve phiên bản số 4.
DMSO 10% là dung môi pha chất được sử dụng như đối chứng âm. Ellipticine được sử dụng làm đối chứng dương ở các nồng độ 20 µg/ml; 4 µg/ml; 0,8 µg/ml, 0,16 µg/ml.
Công thức tính:
% sống sót = [OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)
Các phép thử được lặp lại 3 lần. Giá trị IC50 < 20 µg/ml (với dịch thô hoặc phân đoạn hóa học), IC50 > 4 µg/ml (với hoạt chất tinh khiết) được coi là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.
2.4.2. Hoạt tính chống oxy hóa 2.4.2.1. Phương pháp đo MDA 2.4.2.1. Phương pháp đo MDA
a, Nguyên tắc:
Phương pháp xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid được tiến hành theo phương pháp của E.A.Makarova, 1989; Robak và cộng sự 1988.
Peroxid hóa lipid là một cơ chế thường gặp của những tế bảo bị tổn thương trong thực vật và động vật, nó được coi như là chất chỉ thị của quá trình stress oxy hóa trong tế bào và mô. Xác định khả năng ức chế peroxy hóa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA, MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với thiobarbiturric acid, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử thiobarbituric acid tạo phức màu hồng hấp thụ cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng được thực hiện ở môi trường PH 2-3, ở nhiệt độ 90-1000
C trong vòng 10-15 phút. Sau đó đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu.
b, Phƣơng pháp:
Chuột BALB/c khỏe mạnh, có khối lượng từ 25 – 30g. Pha thuốc thử TBA 0,8%.
Mỗi mẫu thử chất chiết được tiến hành nghiên cứu ở 4 nồng độ: 4000ug/ml; 2000ug/ml; 1000ug/ml; 500ug/ml (các mẫu được pha trong DMSO).
Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15% ở nhiệt độ 0- 50C. Lấy 0,5ml dịch đồng thể, thêm vào 0,1ml các nồng độ mẫu
thử và 1,4 ml đệ ở 370
. Kết thúc phản ứng bằng acid tricloacetic, ly tâm 1000 vòng/phut, lấy 2ml dịch trong cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% và đo màu ở bước sóng 532nm.
Trolox (Calbiochem Ltd, Co.) đồng phân của vitaminE được sử dụng làm chất đối chứng.
c, Cách tính:
Số liệu được xử lí trên hệ thống Excell
Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO)(%) được tính theo công thức:
HTCO(%)= [(ODchứng - ODthử )/ODchứng](%)
Trong đó: ODchứng : mật độ quang của dung mỗi DMSO ODthử : mật độ quang của mẫu thử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.4.2.2. Phương pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột
a,Phương pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột
Chuột BALB/c khỏe mạnh được sử dụng để tách tế bào gan. Gây chết chuột bằng cồn 800, sau đó sử dụng panh, kéo mổ chuột, tách lấy gan. Gan chuột sau khi tách được rửa sạch bằng PBS, thu dịch có tế bào gan, li tâm, loại bỏ dịch nổi. Tế bào được hòa trong NH4Cl để phá vỡ hồng cầu. Sauk hi li tâm, tế bào thu được hòa lại trong môi trường MEME có 10% FBS và các thành phần cần thiết khác.
b, Phép thử sinh học kiểm tra khả năng chống oxy hóa của hoạt chất trên tế bào gan:
Tế bào gan chuột được phân lập bằng trysin 1% cho từng thí nghiệm. Sau khi được phân lập, tế bào gan sẽ được đưa vào đĩa thí nghiệm 96 giếng với mật độ 1x104
tế bào/giếng để nuôi qua đếm trong tủ ấm 5% CO2, ở 370C. Tế bào sau đó sẽ được ủ hoạt chất ở các nồng độ khác nhau trong 2h. Tiếp theo, 100µM H2O2 sẽ được đưa vào mỗi giếng và ủ trong 2h. Để xác định số tế bào gan sống sót sau tác động của H2O2 cũng như tác động của hoạt chất nghiên cứu, MTT nồng độ 1mg/ml (50 µM/giếng) sẽ được đưa vào các giếng và được ủ tiếng 4h ở 370C. Loại bỏ toàn bộ dịch nổi và đưa vào mỗi giếng 100 µM/giếng DMSO 100% và đo mật độ quang học của chất formazan tạo thành bằng máy Microplate Reader ở bước sóng 492nm. Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các số liệu được xử lí bằng phần mềm TableCurve 2D phiên bản 4.0 và exel để tính giá trị trung bình. Độ chính xác của số liệu được tính bằng R2. Nếu R2
≥ 0,95 thì kết quả được xem là đáng tin cậy với sai số thống kê P ≤ 0,05.
c, Công thức tính
% sống sót = [OD(chất thử) - OD(H2O2)] x 100 OD(Tế bào) - OD(H2O2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Giá trị ED50 (nồng độ bảo vệ được 50% đối với sự sống sót của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có ED50 < 20 µg/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc ED50 ≤ 4 µg/ml (với chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính chống oxi hóa và bảo vệ tế bào gan.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1. Phân lập astilbin, một số hợp chất và tạo các cao chiết TPL-EtOH, TPPL-As40 TPPL-As40
3.1.1. Phân lập astilbin và các hợp chất gần astilbin trên sắc ký lớp mỏng 3.1.1.1. Qui trình phân lập astilbin và các hợp chất gần astilbin theo SKLM 3.1.1.1. Qui trình phân lập astilbin và các hợp chất gần astilbin theo SKLM
Mẫu rễ Thổ phục linh khô thu mua ở Tuyên Quang (500g), được sấy khô, nghiền nhỏ và được ngâm, chiết trong ethanol 85% bằng siêu âm trong 30 phút ở 50oC. Quá trình đuợc tiến hành 5 lần (1 x 1,8 L; 4x1L) (kiểm tra SKLM thấy không còn astilbin), gộp các dịch chiết lại rồi quay cất chân không thấp loại dung môi. Phần cặn nước còn lại được chiết với n-hexan (3x 0,05 L) để loại các chất trên. Phần dịch nước được chiết 5 lần với ethyl axetat (1 x 0,05 L; 4 x 0,02 L) kiểm tra SKLM đến hết astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết EtOAc lại, quay cất loại dung môi sau đó phần cặn EtOAc được tách bằng SKC trên silicagen. Bước đầu tiên là qúa trình tách nhanh trên cột silicagen ngắn thu được các phân đoạn gồm: phân đoạn astilbin sạch (5,43 g) (chất 1); phân đoạn astilbin lẫn các chất dưới (3,07 g); phân đoạn astilbin
lẫn các chất trên (2 g); phân đoạn các chất trên 0,5g, phân đoạn các chất dưới (3 g) (Hình 3.1).
- Phân đoạn các chất trên lẫn astilbin được tách lại bằng SKC trên silicagen lặp lại nhiều lần thu được chất 2 là engeletin (dihydrokaempferol -3-
O-Rhamnopyranoside.
- Phần các chất dưới lẫn astilbin đã được tách lại bằng SKC trên silicagen thường, silicagen pha đảo, sephadex thu được hợp chất 3 là 3-O- caffeoyl-shikimic acid
Quá trình phân lập astilbin và 2 hợp chất gần astilbin (trên SKLM) được trình bày trong sơ đồ dưới đây (Hình 3.1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.1: Sơ đồ tách astilbin và các hợp chất gần trên SKLM Rễ thổ phục linh
(500 g)
Cao chiết etanol (58,4 g)
Dịch nước Dịch chiết
n-hexan
Cao chiết EtOAc
(14 g) Cao chiết n-hexan
Astilbin lẫn chất dưới 3,07 g Chất 3: 3-O-caffeoyl- shikimic acid 0,045 g Chất 1 Astilbin 5,43 g Astilbin lẫn chất trên 2 g Astilbin Tổng 6 g Hiệu suất tách 1,2%
- Ngâm chiết bằng etanol (1 x 1,8 L + 4 x 1L) - Chiết, lọc lấy dịch, cô cất loại dung môi
- Pha loãng với nước theo tỉ lệ (1: 1; V/V) - Chiết bằng n- hexan (3 x 0,05 L)
Chiết bằng EtOAc (2x 0,05 L + 3 x 0,02 L ) Quay cất loại dung môi
Tách SKC trên silicagen Hệ dung môi tách n-Hexane : EtOAc
Tách SKCtrên: - silicagen, - pha đảo - sephadex Quay cất loại dung môi Kết tinh Tách SKC Trên silicagen Chất 2: Engeletin (Dihydrokaempferol -3-O-Rha) 0,075 g Hỗn hợp chất trên 0,5 g Hỗn hợp chất dưới 3 g 0,14 g 0,43 g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.1.2. Số liệu phổ của các chất phân lập được
Chất 1: Astilbin Trạng thái: tinh thể trắng FT-IR max (cm-1): 3427, 3263, 2912, 1640, 1603, 1519, 1476, 1363, 1301, 1177, 1070, 977. ESI-MS (m/z ): 486 [M-H+2H2O]- 1 H-NMR (Me3OD; 500MHz): 6,98 (1H,d, J=1,8Hz, H-2‟), 6,86(1H, dd, J = 8,2 Hz, 1,8 Hz, H-6‟), 6,82(1H, d, J = 8,1 Hz, H-5‟), 5,94(1H, d, J= 2,1Hz, H- 6), 5,92(1H, d ,J= 2,1Hz, H-8), 5,10(1H, d, J=10,7, H-2), 4,60(1H, d, J= 10,7 Hz, H-3), 4,28(1H, dd, J= 3,6 Hz, 6,3 Hz, H-3”), 4,07(1H, d, J=1,2Hz, H-1”), 3,68(1H, d, J = 3,3 Hz & 9,6Hz, H-3”), 3,56(1H, dd, J=1,7&3,1 Hz, H-2”), 3,36(1H, d, J = 11,6 Hz, H-4”), 1,21(3H, d, J=6,2Hz, H-6”); 13 C-NMR (MeOD, 125MHz): 196,0(C-4); 168,5(C-7); 165,5(C-5); 164,1(C-9); 147,4(C-4‟); 146,5(C-3‟), 129,2(C-1‟), 120,5(C-6‟); 116,3(C-2‟), 115,5(C-5‟); 102,5(C-10); 102,1(C-1”); 97,4(C-6); 96,2(C-8); 83,9(C-2); 78,5(C-3); 73,8(C-4”); 72,2(C-3”); 71,8(C-2”); 70,5(C-5”); 17,8(C-6”). Chất 2: Engeletin (Dihydrokaempferol-3-O-L-rhamnopyranoside) FT-IR max (cm-1): 3419, 2937, 1634, 1591, 1518, 1458, 1379, 1290, 1170, 1026, 977, 826. ESI-MS (m/z ): 433 [M-H]+ 1 H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm) : 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2‟ and H-6‟), 6,86 (2H, d, J = 8,6 Hz, H-3‟ và H-5‟), 5,94 (1H, d, J = 2,1 Hz, H- 6), 5,91 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-8), 5,14 (1H, d, J = 10,9 Hz, H-2), 4.62 (1H, d, J = 10,9 Hz, H-3), 4,28 (1H, dq, J = 6,2và 9,6 Hz, H-5‟‟), 4,06 (1H, d, J = 1,2Hz, H-1‟‟), 3,68 (1H, dd, J = 3,2 và 9,6 Hz, H-3‟‟), 3,53(1H, dd, J = 1,5 and 3,0 Hz, H-2‟‟), 3,34-3,30(1H, m, H-4”) và 1,21 (3H, d, J = 6,2Hz, H-6‟‟). 13 C-NMR (MeOD, 125MHz): 196,0(C-4); 168,5(C-7); 165,4(C-5);
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 164,0(C-9); 159,3(C-4”); 130,0(C-2‟, 6‟); 128,6(C-1‟); 116,4(C-3‟, 5‟); 102,5(C-10), 102,2(C-1”); 97,4(C-6); 96,3(C-8); 83,7(C-2); 78,6(C-3); 73,7(C-5”); 72,1(C-4”); 71,7(C-2”); 70,5(C-3”); 17,83(C-6”). Chất 3: 3-O-caffeoyl-shikimic acid Trạng thái: tinh thể trắng ESI-MS (m/z ): 335[M-H]- 1 H-NMR (Me3OD; 500MHz): 7,58 (1H, d, J= 15,0Hz, H-8‟), 7,07(1H, d, J = 2 Hz, H-2‟), 6,96(1H, dd, J = 2 Hz, 8,2 Hz, H-6‟), 6,8(1H, d, J = 8,2 Hz, H-5‟), 6,59-6,56(1H, m, H-6), 6,30(1H, d, J = 15,9 Hz, H-7‟), 5,28-5,24(1H, m, H-3), 4,36(1H, t, J= 4,2 Hz, H-5), 3,84(1H, 2xd, J= 4,3 Hz, H-4), 2,97(1H, 2xd, J = 5,4 Hz, H-2a), 3,34(1H, 2xd, J= 7,3 Hz, H-2b). 13
C-NMR (MeOD, 125MHz):175,0(COOH), 169,0 (COO), 149,6(C-4‟), 147,0(C-3‟), 146,8(C-8‟), 137,1(C-6), 131,9(C-1), 127,8(C-1‟), 122,9(C-6‟), 116,5(C-5‟), 115,4(C-7‟), 115,1(C-2‟), 71,9(C-3), 71,4(C-4), 67,9(C-5), 31,7(C-2).
3.1.2. Khảo sát một số vùng nguyên liệu Thổ phục linh ở miền Bắc 3.1.2.1. Thu mua Thổ phục linh tại các vùng khảo sát 3.1.2.1. Thu mua Thổ phục linh tại các vùng khảo sát
Thổ phục linh Việt Nam được mua tại 8 tỉnh và thành phố ở miền Bắc là
Thái Nguyên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Quảng Ninh, Sapa, Sơn La, Hòa Bình. Các mẫu Thổ phục linh các vùng được trình bày trong các hình dưới đây:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu TPL Sơn La Mẫu TPL Hòa bình
Mẫu TPL Thái Nguyên Mẫu TPL Tuyên Quang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu TPL Vĩnh Phúc Mẫu TPL Sapa
Hình 3.2: Hình ảnh các mẫu Thổ phục linh ở các vùng
3.1.2.2. Quy trình chung phân lập và xác định hàm lượng astilbin từ rễ Thổ phục linh khô phục linh khô
Mẫu rễ Thổ phục linh khô (500g), được sấy khô, nghiền nhỏ và được ngâm, chiết trong ethanol 85% bằng siêu âm trong 30 phút ở 50o
C. Quá trình đuợc tiến hành 5 lần (1 x 1,8 L; 4x1 L) ( kiểm tra SKLM thấy không còn astilbin) gộp các dịch chiết lại rồi quay cất chân không thấp loại dung môi. Phần cặn nước còn lại được chiết với n-hexan (3x 0,05 L) để loại các chất trên. Phần dịch nước được chiết 5 lần với ethyl acetate ( 1 x 0,05 L + 3 x 0,02 L) kiểm tra SKLM đến hết astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết EtOAc lại, quay cất loại dung môi sau đó phần cặn EtOAc được tách bằng SKC trên silicagen thu được gồm: astilbin thô có lẫn dạng vết của chất trên và chất dưới; phần chất dưới lẫn astilbin; phân chất trên lẫn astilbin;
-Astilbin thô được kết tinh lại trong MeOH: H2O (1:1, v/v) cho astilbin khoảng 95%.
-Phần chất dưới lẫn astilbin và phần chất trên lẫn astilbin được tách tại bằng SKC trên silicagen thu được thêm astilbin có độ sạch tương đối được kết tinh lại cho astilbin có hàm lượng khoảng 95% theo HPLC.
-Hàm lượng astilbin trong rễ thổ phục linh được tính bằng tổng lượng astilbin thu được từ 3 phân đoạn tách trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3: Sơ đồ phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh khô
Rễ Thổ phục linh
(500 g)
Cao chiết etanol
Dịch nước Dịch chiết
n-hexan
Cao chiết EtOAc Cao chiết
n-hexan Astilbin lẫn chất dưới Chất Astilbin thô Astilbin lẫn chất trên Astilbin tổng
- Ngâm chiết bằng etanol (1 x 1,8 L + 4 x 1 L ) - Chiết, lọc lấy dịch, cô cất loại dung môi
- Pha loãng với nước theo tỉ lệ (1: 1; V/Vml) - Chiết bằng n- hexan (3 x 0,05 L)
Chiết bằng EtOAc (2 x 0,05 L + 3 x 0,02 L ) Quay cất loại dung môi
Tách SKC trên silicagen Hệ dung môi tách n-Hexane : EtOAc
Tách SKCtrên: - silicagen, - pha đảo - sephadex Quay cất loại dung môi Kết tinh Tách SKC Trên silicagen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.3. Giám định thu mua mẫu và xử lý mẫu Thổ phục linh 3.1.3.1. Giám định mẫu thực vật 3.1.3.1. Giám định mẫu thực vật
Sau khi đã khảo sát vùng nguyên liệu về hàm lượng astilbin ở các vùng và khả năng thu mua mẫu lượng lớn ở các vùng chúng tôi đã chọn vùng nguyên liệu cho thu mua mẫu là tỉnh Tuyên Quang. Để giám định mẫu thực vật, mẫu cây bao gồm: củ, thân cành lá đã được thu thập tại Tuyên Quang và được giám định mẫu tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, do PGS. TS. Trần Huy Thái và TS. Nguyễn Thế Cường giám định (có kèm theo văn bản “Kết quả giám định tên khoa học”).
Hình : Thổ phục linh tươi Hình : Củ Thổ phục linh tươi
Hình 3.4: Mẫu Thổ phục linh thân lá và củ tƣơi
Mẫu thực vật được giám định thuộc loài Smilaxg glabra Roxb., họ Smilacaceae.
3.1.3.2. Thu mua và xử lý mẫu
Mẫu rễ Thổ phục linh tươi (200 kg) thu mua tại Tuyên Quang được rửa sạch, để ráo nước, rồi đem thái mỏng và phơi khô trong vài ngày sau đó sấy trên tủ sấy thường ở 400
C trong 2 ngày đến khô hẳn rồi để nguội cân được 65 kg. Thổ phục linh lát mỏng khô được đóng bao trong túi polyethylene kín và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
được sấy lại trước khi nghiền thành bột. Một số hình ảnh về mẫu Thổ phục linh tươi được thu mua tại Tuyên Quang, được trình bày trong hình 3.5.
Củ tươi TPL TPL thái mỏng
Hình 3.5: Hình ảnh mẫu Thổ phục linh tƣơi tại Tuyên Quang
3.1.4. Tạo các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40
Mẫu rễ Thổ phục linh khô 10 kg được sấy khô, nghiền nhỏ và được cho vào trong thiết bị chiết thủy tinh có van khóa ở đáy, ethanol 85% (40 L) được cho vào và hỗn hợp được ngâm ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày với khuấy nhiều lần rồi tháo khóa lấy dịch chiết. Sau khi dịch chiết được tháo kiệt, ethanol 85% (30 L) được cho vào bình. Hỗn hợp được ngâm và lấy dịch chiết tương tự như vậy thêm 4 lần nữa (4 x 30 L), kiểm tra dịch chiết thấy không còn vết của astilbin thì dừng chiết. Các dịch chiết được kết hợp lại và quay cất loại dung môi trên thiết bị cô quay chân không 20 L. Phần dịch cặn (cao chiết etanol, 1,2kg ) được chiết nhiều lần bằng n-hexan (1 x 1 L + 3 x 0,6 L) để loại các chất không phân cực. Phần cặn nước còn lại được chiết 5 lần với etyl acetate(1 x 0,5 L + 4 x 1 L ), kiểm tra SKLM đến hết astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết EtOAc lại, quay cất loại bớt dung môi sau đó được tủa bằng các dung môi khác nhau thu được 144 g astilbin (TPL-As40) và các phân đoạn TPL-Đường (62 g), cặn chất trên astilbin (48 g) như trong sơ đồ