Việc thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết TPL-EtOH và TPL-As40 được thực hiện tại phòng thử nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học.
a, Vật liệu
Hoạt chất: TPL-EtOH dạng bột màu vàng đen, dễ chảy rữa; TPL-As40
chất bột màu vàng nhạt.
Hoá chất: DMSO, MTT, H2O2, Cucurmin.
Động vật: chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không mắc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Dụng cụ thí nghiệm: đĩa nhựa 96 giếng, pipet, eppendorfvà các thiết bị
phụ trợ khác.
Thiết bị: Cân phân tích, máy đo OD Microplate Reader, Box cấy vô trùng
b, Phƣơng pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột
Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan. Khử trùng và giết chết chuột bằng cồn 70oC, tách lấy gan. Rửa gan bằng dung dịch PBS có 10% kháng sinh. Dùng panh, kéo, kim tiêm gạt, tách tế bào gan trong PBS. Thu dịch có tế bào gan, li tâm, loại bỏ dịch nổi. Hoà cặn tế bào trong NH4Cl, li tâm thu cặn tế bào, cho môi trường MEME có 10% FBS và các thành phần cần thiết khác. Nuôi trong tủ ấm ở 37o
C, 5% CO2.
c, Phép thử sinh học kiểm tra khả năng chống oxy hoá của hoạt chất trên tế bào gan
Tế bào gan sau phân lập được nuôi ổn định 1-2 ngày, sau đó đưa vào đĩa 96 giếng với mật độ 1 x 104
tế bào/giếng, nuôi qua đêm trong tủ ấm 5% CO2, ở 37o
C.
Thêm hoạt chất nghiên cứu hoặc Cucurmin (đối chứng dương) ở các nồng độ khác nhau, ủ trong 2 giờ.
Thêm 100 M H2O2 vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ. Cho 50 l/giếng MTT nồng độ 1mg/ml, ủ trong 4 giờ.
Loại bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi giếng 100 l DMSO 100%.
Đo mật độ quang học (OD) bằng máy Microplate Reader ở 492 nm.
% sống sót = [OD(chất thử) - OD(H2O2)] x 100 OD(Tế bào) - OD(H2O2)
Giá trị ED50 (nồng độ bảo vệ được 50% đối với sự sống sót của tế bào) được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2D phiên bản số 4 và Excell để tính giá trị Standard Deviation. Độ chính xác của số liệu được tính bằng R2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Astilbin và một số hoạt chất tách đƣợc từ rễ Thổ phục linh
Astilbin và một số hợp chất cạnh nó trên SKLM là những hợp chất khó phân lập ra khỏi astilbin, tuy nhiên chúng đã được tách theo phương pháp chung như trình bày trong sơ đồ hình 3.1. Rễ thổ phục linh khô đã được nghiền nhỏ (500 g) được ngâm chiết với cồn 85% nhiều lần và được kiểm tra SKLM để đảm bảo đã chiết kiệt astilbin trong mẫu chiết. Sau đó kết hợp các dịch chiết lại rồi quay cất loại dung môi thu được cao chiết tổng TPL-EtOH. Cao chiết TPL-EtOH được loại bớt các phần không phân cực bằng việc tạo huyền phù với nước theo tỉ lệ (1:1, v/v) sau đó chiết nhiều lần với n-hexan. Phần dịch nước còn lại được chiết với etyl axetat nhiều lần đảm bảo chiết kiệt astilbin trong dịch nước (kiểm tra bằng SKLM). Dịch etyl axetat được kết hợp lại rồi quay cất loại dung môi thu được cặn chiết etyl axetat. Cặn chiết này được tách bằng sắc cột trên silicagen với hệ dung môi rửa giải n-hexane : EtOAc với các tỉ lệ tăng đần EtOAc để thu được astilbin tương đối sạch và các phần dung dịch gồm: Các chất trên astilbin (0,5 g) + Các chất trên astilbin lẫn astilbin (2 g) + Astilbin tương đối sạch (5,43 g) + Astilbin lẫn các chất dưới (3,07 g) + Các chất dưới astilbin (3 g).
- Phân đoạn astilbin lẫn chất trên được tách qua sắc ký cột trên silicagen
lặp lại nhiều lần thu được hợp chất dihydrokaempferol-3-O-L-
rhamnopyranoside (Chất 2).
- Phân đoạn astilbin lẫn chất dưới được tách qua cột sắc ký trên silicagen pha thường, silicagen pha đảo, sephadex thu được chất ngay sát dưới astilbinmàu đỏ là 3-O-caffeoyl-shikimic acid (0,045g) ( Chất 3).
Các hợp chất phân lập được từ rễ Thổ phục linh được trình bày trong bảng 4.1:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 4.1: Cấu trúc phân tử của 3 hợp chất tách đƣợc rễ Thổ phục linh
Chất Công thức cấu tạo Tên chất
1 Astilbin (Taxifolin-3-O-L- rhamnopyranoside) 2 Engeletin (Dihydrokaempferol-3- O-L-rhamnopyranoside) 3 3-O-caffeoyl-shikimic acid
Biện luận cấu trúc phân tử các hợp chất đã tách
Chất 1 : Astilbin (Taxifolin 3-O-L-rhamnopyranoside):
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các dữ liệu phổ của sản phẩm astilbin phân lập phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ của hợp chất này trong các tài liệu đã được công bố. Phổ khối ion hóa phun mù điện tử cho pic ion giả phân tử [M-H+2H2O]- với m/z= 486 phù hợp với trọng lượng phân tử của astilbin. Trên phổ proton 1
H-NMR của sản phẩm astilbin tại vùng trường thấp xuất hiện cụm tín hiệu của 3 proton vòng thơm B ở δ6,98 (1H, d, J=1,8Hz), ở δ6,86 (1H, dd, J = 8,2 Hz, và 1,8 Hz) và 6,82(1H, d, J = 8,1 Hz) cho thấy vòng B đã bị thế vào 2 vị trí C-3‟ và 4‟). Ở trường cao hơn 2 tín hiệu duplet ở 5,94ppm (1H, d, J= 2,1Hz) và tín hiệu ở 5,92(1H, d ,J= 2,1Hz) là các tương tác proton vị trí meta chứng tỏ vòng thơm A đã bị thế ở vị trí C-5 và C-7 và đó là các tín hiệu doudlet của 2 proton H-6 và H-8. Tín hiệu của các proton H-2, H-3 là các doudlet ở δ5,10 (d, J=10,7, 1H) và δ4,60 (d, J=10,7 Hz), với hằng số tương tác lớn thể hiện 2 proton này ở vị trí khác phía so với mặt phẳng phân tử. Các tín hiệu của đường Rhamnose gắn vào phân tử thể hiện rõ trên các tín hiệu dupquatet của proton H-5” ở δ4,28(1H, dq, J= 3,6 Hz, và J= 6,3 Hz) do tương tác với các proton của nhóm methyl 6-CH3 và proton H-4”. Đặc biệt rõ nét proton anome H-1” ở 4,07ppm (d, J=1,2Hz). Các tín hiệu dupduplet của H-3”, H-2”, ở 3,68(dd, J= 3,3Hz & 9,6Hz), 3,56(dd, J=1,7&3,1 Hz). Tín hiệu proton của H-4” bị che phủ bởi tín hiệu của proton metanol OCH3 ở 3,36ppm. Tín hiệu nhóm 6-CH3 là doudlet ở 1,21ppm(J=6,2Hz).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 4.2: Phổ 1H-NMR của astilbin
Phổ cac bon 13
C-NMR cũng đã chỉ ra tín hiệu của 21 cacbon bao gồm 1 nhóm keton 4-CO ở δ196, 12 cacbon của hệ thơm 2 vòng A và B và 1 cacbon của C-1” anome nằm từ 168,5ppm đến 96,2 ppm. Tiếp theo là tín hiệu 2 cac bon của C-2 ở 83,9 và C-3 ở 78,5. Cuối cùng là 5 tín hiệu của các bon của đường rhamnoside ở δ 73,8 (C-4”), 72,2(C-3”), 71,8(C-2‟), 70,5(C-5”) và 17,8 (C-6”).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chất 2: Engeletin (Dihydrokaempferol-3-O-L-rhamnopyranoside)
Hình 4.4: Engeletin
Các dữ liệu phổ của chất 2 (engeletin) phù hợp với cấu trúc phân tử và
các dữ liệu phổ của hợp chất này trong các tài liệu đã được công bố. Phổ khối ion hóa phun mù điện tử cho pic ion giả phân tử [M-H]+với m/z= 433 phù hợp với trọng lượng phân tử. Phổ proton 1H-NMR của engeletin cho các tín hiệu của proton vòng thơm B khác với astilbin. Tại vùng trường thấp xuất hiện 2 cặp duplet ở δ7,37 (2H, d, J= 8,5 Hz) và δ6,86 (2H, d, J = 8,6 Hz) là tín hiệu các cặp proton ở vị trí ortho-của protonH-2‟, H-6‟ và H-3‟ 5‟ cho thấy vòng thơm B đã bị thế ở vị trí para.Ở trường thấp hơn 2 cặp duplet ở δ5,94 (2H, d, J = 2,1 Hz) và δ5,91 (2H, d, J = 2,1 Hz) với hằng số tương tác nhỏ là các tương tác metha gợi ý vòng A bị thế vào vị trí C-3 và C-5. Tiếp theo là tín hiệu của 2 cặp duplet ở δ5,14 (1H, d, J = 10,9 Hz) và ở δ4,62 (2H, d, J = 10,9 Hz) với hàng số tương tác lớn chỉ ra đây là 2 proton ở 2 phía của mặt phẳng phân tử đó là các tín hiệu của các proton H-2, H-3. Các tín hiệu của đường Rhamnopyranoside gắn vào phân tử thể hiện rõ trên các tín hiệu dupquatet của proton H-5” ở δ4,28(1H, dq, J= 6,2 và 9,6 Hz) do tương tác với các proton của nhóm methyl 6-CH3 và proton H-4”. Các tín hiệu còn lại cũng xuất hiện giống như trong phân tử astilbin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 4.5: Phổ 1H-NMR của engeletin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chất 3: 3-O-caffeoyl-shikimic acid
Hình 4.7: 3-O-caffeoyl-shikimic acid
Các dữ liệu phổ của chất 3 (3-O-caffeoyl-shikimic acid) phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ của hợp chất này đã được công bố. Phổ khối ion hóa phun mù điện tử cho pic ion giả phân tử [M-H]-với m/z= 335 phù hợp với trọng lượng phân tử. Trên phổ proton 1
H-NMR của chất 3 ở trường thấp là tín
hiệu duplet ở δ7,58(1H, J = 15,0 Hz) của proton H-8‟ do ảnh hưởng của nhóm 9‟-CO đã dịch chuyển xuống trường thấp hơn so với duplet của proton H-7‟ ở δ6,30(1H, J = 15,9 Hz), hằng số tương tác lớn chứng tỏ các proton này tương tác với nhau ở vị trí trans. 3 cụm tín hiệu các proton thơm hệ ABX của mảng cafeoyl ở δ7,07(1H, d, J = 2 Hz), δ6,96(1H, dd, J = 2, 8,2 Hz) và ở δ6,80 (1H, d, J = 8,2 Hz) gợi ý vòng thơm này đã bị thế ở các vị trí C-1‟,C-3‟ và C-4‟ và các tín hiệu này là của các proton H-2‟, H-6‟ và H-5‟ tương ứng. Các tín hiệu proton của mảng shikimic acid trong phân tử cũng thể hiện rõ trên phổ 1
H-NMR. Tại δ6,6(1H, 2xd, J = 2,1 Hz)là tín hiệu của proton metin H-6. Hai cặp duplet tại δ 2,97(2xd, J = 5,4 Hz) và δ 2,34(2xd, J = 7,4 Hz) là các tín hiệu của 2 proton methylen 2‟-CH2. 3 proton hydroxyl metin ở 5,28-5,24 ppm (m, 1H, H-3), δ4,36(t, J = 4,2 Hz, H-5) và δ3,84(2xd, J = 4,3 Hz, H-4), trong đó tín hiệu của H-3‟ do ảnh hưởng của nhóm thế cafeyol đã dịch chuyển xuống trường thấp hơn. Phổ 13
C-NMR của chất 3 cho tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon, ở trường thấp là tín hiệu của các nhóm cabonyl ở δ 175(COOH) và δ169,0(9‟-CO). Ở trường cao hơn là các tín hiệu của các cabon hydroxyl metin, metin và metylen. Phổ HSQC và phổ HMBC cũng cho ta thấy các tương tác trực tiếp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
và tương tác xa của các proton với các nguyên tử cacbon liên quan. Trên HMBC ta thấy các tương tác xa của 9‟-CO(δ169,0) /H-8‟ (δ 7,58); H-7‟(δ 6,3); H-3(5,28-5,24 ppm) cho thấy vị trí liên kết của mảng cafeoyl vào vị trí Cacbon C-3. Ta cũng thấy các tương tác ngang trong mảng cafeoyl của cacbon C-1‟(δ127,8)/H-8‟(δ7,58); H-5‟(δ6,80); H-7‟(δ6,30). Kết hợp các dữ liệu của các loại phổ và đối chiếu với các số liệu được công bố trên các tài liệu chất 3 được khẳng định là 3-O-caffeoyl-shikimic acid.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 4.9: Phổ 13C-NMR của chất 3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
4.2. Khảo sát hàm lƣợng astilbin trong rễ TPL tại miền Bắc
Kết quả khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ thổ phục linh tại 8 tỉnh miền bắc và mẫu thổ phục linh Trung Quốc được trình bày trong bảng 4.2 cho thấy hàm lượng astilbin trong rễ thổ phục linh Việt Nam cao gấp nhiều lần mẫu thổ phục linh Trung Quốc mua tại phố Lãn Ông. Hàm lượng astilbin trong mẫu thổ phục linh Việt Nam tại các tỉnh là khá cao từ 0,8-1,1% so với trọng lượng mẫu củ khô (trừ vùng Sơn La 0,74%). Kết quả thu được cho thấy thổ phục linh Việt Nam có chất lượng tốt, đó sẽ là cơ sở cho việc khai thác và sử dụng nguồn dược liệu quí này.
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát hàm lƣợng astilbin trong rễ TPL tại 8 tỉnh miền Bắc
STT dược liệu Nguồn Địa điểm và thời gian thu, mua mẫu
Hiệu suất tách Astilbin (% )
2 Trung Quốc
Mua tại phố Lãn Ông Hà Nội, Tháng 2/2012 0,3 0,31 3 Việt Nam Tuyên Quang 0,89 4 Thái Nguyên 0,92 5 Bắc Giang 0,82 6 Hòa Bình 1,18 7 Sơn La 0,74 8 Sa Pa 0,81 9 Quảng Ninh 1,17 10 Vĩnh Phúc 0,87
4.3. Cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40
Các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40 được tạo theo phương pháp chung đã được trình bày ở sơ đồ hình 3.6. Rễ Thổ phục linh khô 10 kg đã được nghiền nhỏ, ngâm chiết với cồn 85% nhiều lần, kiểm tra SKLM đến khi hết astilbin trong dịch mẫu. Các dịch chiết được kết hợp lại và quay cất loại dung môi thu được cao chiết TPL-EtOH. Cao chiết TPL-EtOH được chiết nhiều lần với n-hexan để loại các chất không phân cực. Phần cặn nước được chiết nhiều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lần với etyl axetat đến khi kiệt astilbin trong dịch nước. Kết hợp các dịch chiết etyl axetat, quay cất loại dung môi rồi tủa bằng các dung môi khác nhau thu được 144 g astilbin (TPL-As40) và các phân đoạn TPL-Đường (62 g), cặn chất trên astilbin (48g).
4.4. Hàm lƣợng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40
Các cao chiết được xác định hàm lượng astilbin dựa vào kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng astilbin trên thiết bị HPLC đã được thiết lập trong phần thực nghiệm.
4.4.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng astilbin
Về nguyên tắc phân tích, khi đã định tính được píc nào trên sắc ký đồ tương ứng với chất nào và đã có sắc ký đồ của các mẫu chuẩn với những nồng độ khác nhau thì ta có thể tính ra nồng độ của chất cần phân tích bằng phương pháp đường chuẩn, cách thức làm như sau:
-Vẽ đồ thị của diện tích píc theo nồng độ, từ đó dùng phương pháp bình phương tối thiểu để suy ra đường hồi quy.
-Từ phương trình hồi quy dạng Y = AX + B trong đó Y là diện tích píc, X là nồng độ của chất phân tích, A,B là các hệ số hồi quy, căn cứ vào sắc ký đồ của mẫu ta có được Y của chất cần phân tích, dựa vào phương trình này ta sẽ suy ra được nồng độ của chất cần phân tích trên đường chuẩn.
-Từ nồng độ này, căn cứ vào khối lượng hay thể tích của mẫu cũng như các thể tích pha loãng thì sẽ suy ra được hàm lượng của chất cần phân tích trong các mẫu.
Trên cơ sở đó, từ dung dịch astilbin gốc nồng độ 1 mg/ml tiến hành pha loãng tạo các dãy dung dịch bằng dung môi. Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 15.256; 31.25; 62.5; 250; 500µg/ml (Bảng 4.3). Tiến hành lập danh sách các mẫu chạy theo thứ tự lần lượt từ nồng độ thấp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đến cao. Chạy Sequence với bơm tự động và chương trình chạy được lập trình bằng sự hỗ trợ của phần mềm Chemstation.
Trên sắc ký đồ UV của tất cả các mẫu astilbin đều cho tín hiệu ổn định tại thời gian lưu 19.0 phút. Chúng tôi đã tiến hành dựng đường chuẩn định lượng biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ dựa trên sắc ký đồ UV.
Hình 4.11: Sắc ký đồ của hợp chất astilbin tại bƣớc sóng 291 nm trên cột Zobax eclipse XDB C18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Từ các số liệu về diện tích píc và nồng độ tiến hành xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích píc và nồng độ có phương trình hồi quy tuyến tính là Y= 17857.54213X – 71.18024, có độ tin cậy cao (R2
= 0.9998). Kết quả được trình bày trên hình 4.12 và bảng 4.3.
Bảng 4.3: Đƣờng chuẩn, r2, LOD, LOQ của các chất Astilbin
Đường chuẩn r2 LOD (μg/ml) LOQ (μg/ml) Dải nồng độ (μg/ml) Astilbin Y= 17857.54213X - 71.18024 0.9998 7.8 15.625 15.625-500
4.4.2. Đánh giá hàm lượng hợp chất astilbin trong mẫu cao chiết Thổ phục linh
Dễ dàng nhận thấy: nếu có chất chuẩn việc sàng lọc và xác nhận sự có mặt của hợp chất asilbin trong mẫu phân tích chỉ cần tiến hành việc phân tích mẫu và chất chuẩn trên cùng một điều kiện phân tích, kết quả là sự so sánh thời gian lưu của chất chuẩn với píc xuất hiện trên sắc ký đồ của mẫu phân tích.
Hình 4.13: Sắc ký đồ của mẫu TPL-As4O và astilbin trên cột Zorbax eclipe XBD C18 (4,6 x 150 mm, 5µm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/